蛋白激酶A在转化生长因子β-1刺激增生性瘢痕成纤维细胞增殖中的作用
张选奋 鲁开化 李荟元 郭树忠 李向东
［摘 要］ 目的：探讨蛋白激酶A在转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(HS-FB和NS-FB)增殖中的信号转导作用。 方法：利用32P掺入底物法测定HS-FB和NS-FB的PKA活性；使用直接计数法和MTT法测定TGF-β1和cAMP、H7等刺激两种细胞后增殖能力的变化。 结果：NS-FB被TGF-β1刺激后PKA的活性短暂升高后很快恢复(30min内，但P＞0.05)，HS-FB则在30～60min降低(P＜0.05)，1h后恢复；HS-FB的PKA活性比NS-FB低(但P＞0.05)。TGF-β1能强烈刺激两种细胞增殖(30min后P＜0.05)，对HS-FB的刺激作用更强(刺激60min后P＜0.05)。cAMP可抑制两种细胞增殖(60min后P＜0.05)，H7有拟TGF-β1作用(30min后P＜0.05)，H7还可增强TGF-β1的刺激作用(30～60min后P＜0.05)。 结论：TGF-β1刺激后PKA的活性在两种细胞有不同的变化，提示两种细胞的cAMP/PKA信号通道存在一定的差异；TGF-β1刺激作用部分经PKA活性变化介导，但活化PKA通道可以逆转TGF-β1的作用。
［关键词］ 信号转导 蛋白激酶A 转化生长因子-β1 成纤维细胞 增殖
［中图分类号］R619+.6 ［文献标识码］A
［文章编号］1008-6455(2000)06-0413-04
THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-β1 STIMULATING PROLIFERATION OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLAST
ZHANG Xuan-fen LU Kai-hua LI Hui-yuan et al.
(Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University Xi'an 710032)
［Abstract］Objective：To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-β1 stimulating proliferation of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB). Methods：The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by 32 P incorporation assay.Cell proliferation was measured by methyltetrazolium assay and cell count after TGF-β1,cAMP and H7 stimulating. Results：The activity of PKA of NS-FB was risen temporarily insignificantly and recovered soon while the one of HS-FB was decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-β1 (P＜0.05).TGF-β1 could stimulate proliferation of FB(P＜0.05 at stimulating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(P＜0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P＜0.05 at stimulating 60 minutes later) while H7 could improve roles of TGF-β1(P＜0.05 at 30～60 minutes of stimulation). Conclusion：The changes of the PKA activity of the two types of cell after the stimulation of TGF-β1 might implicate that there was difference in the PKA signal pathway. The effects of TGF-β1 stimulating cell proliferation might have partly relation to cAMP/PKA pathway but the activation of cAMP/PKA signal pathway could abrogate the effects of TGF-β1.
［Key words］ Signal transduction PKA TGF-β1 Fibroblast Proliferation
环磷酸腺甙(cyclic Adenosine Monophosphate简称cAMP)——蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)信息途径活化对许多细胞如血管内皮细胞(Endothelial Cell,EC)〔1〕、血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)〔2,3〕和成纤维细胞(Fibroblast,FB)〔4〕等瘢痕形成相关细胞有促进分化和凋亡、抑制增殖作用。转化生长因子β1(transforming growth factor β1 简称TGF-β1)刺激能强烈加速FB、EC和VSMC等细胞增殖。尚不清楚TGF-β1对增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB 和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)的cAMP/PKA通道的影响以及cAMP/PKA 通道在FB增殖中的作用。我们做了研究，报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
标本：原代培养HS和正常人皮肤组织(各4例，均系我院手术病例)。二者在年龄、性别和部位等方面匹配。细胞成片后传代。实验用4～10代细胞。
试剂：leupeptin、aprotanin、H7、MTT和PMSF购自sigma公司。PKA检测kit、cAMP和TGF-β1购自Promega 公司。蛋白质定量kit购自Bio-RAD公司。［-32p］ATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司。DMEM购自Hyclone公司。其它试剂均为分析纯或更纯。
仪器：Beckman GS-15R冷冻高速离心机；Polytron 超声匀浆仪；Beckman LS6500液闪仪；Perkin Elmer Lambda14紫外可见光分光光度计和Labsystems Dragon 公司Wellscan MK2型酶标仪等。
1.2 方法
1.2.1 PKA活性测定
酶样准备：细胞置25cm培养瓶用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的 DMEM常规培养48h，0.5%FBS的DMEM饥饿24h，TGF-β15ng/ml、H7 250μM、cAMP0.025mM和TGF-β15ng/ml加H7 250μM刺激10、30、60和120min,冰浴上用细胞刮刀收集细胞，立即置液氮中冻存。
冰浴上融化细胞，加入预冷的样品缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.4，0.5mM EDTA,0.5mM EGTA，10mM β-巯基已醇，1μg/ml leupeptin,lμg/ml aprotanin, 5mM PMSF)500μl，预冷的涡旋混合仪和超声匀浆仪混匀和匀浆，14000g离心5min，留上清液作为酶样。操作均在0～4℃进行。
PKA活性测定：按试剂盒说明进行。按0.5mM ATP 5μl和［-32p］ATP(3000ci/m mol)10ci/μl 0.05μl准备ATP混合物并混匀。反应总体积为25μl。PKA测定缓冲液5×(200mM Tris-HCl pH7.4，100mM MgCl2，0.5mg/ml BSA)、PKA多肽底物、［-32p］ATP混合物和去离子水各5μl，混匀。空白反应用去离子水代替PKA底物。30℃温育5min，加酶样5μl启动反应，准确30℃温育5min(温育时间、酶样要否稀释由预实验确定)。加12.5μl终止缓冲液终止反应。每样品均为双复管。点反应混合液10μl到SAM2M膜，依次洗膜：2M NaCl 200ml 30sec1次，2M NaCl 200ml 2min2次，含1%磷酸的2M NaCl 200ml 2min3次，100ml去离水30sec 2次，共约12～15min。另外，任取两个反应液各5μl点到SAM2M膜但不洗。所有膜均在室温干燥。置膜于液闪瓶，加闪烁液2ml后液闪计数。
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