体外培养血管平滑肌细胞与内皮细胞增殖的影响
潘勇 艾玉峰
摘 要 目的：研究在体外培养条件下兔血管内皮细胞条件培养基(ECCM)、内皮素-1(ET-1)、内皮素转化酶抑制剂(Endothelial-coverting enzyme inhibitor)Phosphoramidon 对血管平滑肌细胞(SMC)增殖的影响，同时研究了血管平滑肌细胞条件培养基(SMCCM)对血管内皮细胞(EC)增殖方面的影响。方法：EC和SMC均来源于兔主动脉，在获得了EC和SMC的条件培养基(CM)后，分别用两者以及ET-1进行实验，细胞的增殖率通过3H掺入法进行测定。结果：ECCM和ET-1可明显促进SMC的增殖，并呈现剂量依赖性。其最大效应分别为190%±11%(100% ECCM)和166%±9%(100pg/ml ET-1)。而Phosphoramidon存在条件下的ECCM使其分裂作用降低33%±2%。SMCCM抑制EC的增殖，这种抑制作用并非剂量依赖性，其最大的抑制效应为基本水平的78%±3%。结论：ECCM和ET-1可促进SMC的增殖。Phosphoramidon可明显地抑制ECCM对SMC的增殖作用。同时SMCCM对EC的增殖起抑制作用。
关键词 血管内皮细胞 血管平滑肌细胞 增殖
MODULATIONS OF PROLIFERATION BETWEEN VASCULAR ENDOTHELIAL CELL AND VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELL IN VITRO
Pan Yong Ai Yufeng
（Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University Xi'an 710032）
Abstract Aim:To study the effects of vascular endothelial cell conditioned medium(ECCM), endothelin-1 (ET-1), Endothelin-converting enzyme inhibitor Phosphoramidon on the proliferation of vascular smooth muscle cell (SMC) and vascular smooth muscle cell conditioned medium(SMCCM) on the proliferation of vascular endothelial cell(EC)in vitro.Methods:EC and SMC were isolated from rabbit aortas and cultured.The conditioned medium(CM) of EC and SMC were harvested.ECCM,ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon,SMCCM and ET-1 were added individually to the cultures.Proliferation rate of the cells was measured with 3 H-thymidine incorporation on 3 days. Result:ECCM and ET-1 significantly increased the proliferation of SMC in a dose-dependent manner with a maximal effect of 199%±11%(100% ECCM) and 166%±9%(100pg/ml ET-1)respectively.ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon reduced the mitogenic effect by 33%±2%.SMC conditioned medium elicited a dose dependent decrease of cultured EC proliferation with a maximal effect of 78%±3% over basal level. Conclusion:ECCM and ET-1 had a mitogenic effect on SMC.Phosphoramidon could significantly reduce the mitogenic effect of ECCM.SMCCM had an effective inhibition on EC proliferation.
Key words Vascular endothelial cell Vascular smooth muscle cell Proliferation
血管内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)是大血管壁的两种主要细胞类型，在结构及功能上存在密切联系，血管内皮层的完整对血管的稳定性起着很大作用〔1〕，EC通过释放血管收缩和舒张物质，且在二者的相互影响下调节着血管的紧张程度。此外SMC也影响着EC血管活性因子的合成与分泌。本研究是组织工程人工血管实验研究的一部分，其目的是为EC和SMC间复杂的调节作用，即有关细胞复制、生长因子活性和增殖方面提供一定的实验依据。本实验主要研究①血管内皮细胞条件培养基(ECCM)、内皮素-1(ET-1)和内皮素转化酶抑制剂(Endothelial-coverting enzyme inhibitor)Phosphoramidon 存在条件下ECCM对SMC增殖的影响作用；②血管平滑肌细胞条件培养基(SMCCM)对体外培养的EC增殖作用的影响。实验采用细胞培养方法排除血管壁其它组成部分可能存在的干扰作用。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
EC来源于重2.5kg～3.0kg新西兰雄性家兔的主动脉。家兔由第四军医大学实验动物中心提供。动物经戊巴比妥钠(30mg～40mg/kg，iv)麻醉后，无菌条件下取出主动脉，迅速放入PBS液中。将血管内径翻转，冲净内壁后，放入含1mg/ml胶原酶(Ⅰ型，Gibco公司)、4mg/ml牛血清白蛋白的DMEM(Dulbecco's midufued Eagle medium,Gibco公司)培养液中，放于37℃条件下25分钟。收集消化液并离心，将离心下的兔主动脉EC吹打均匀，培养在含20%新生牛血清(Hyclone公司)的DMEM液中。当细胞融合为单层时，用0.125%胰蛋白酶进行消化传代。实验采用的EC为第3～8代细胞。SMC采用组织块法进行培养，即将血管平滑肌层切割成1.0mm3的小块，然后在10%新生牛血清(Hyclone公司)的DMEM培养液中进行培养。培养条件为37℃、5% CO2、95%空气。每周更换培养液2次。当原代培养的细胞达到相对融合状态时，用0.125%胰蛋白酶进行消化传代。实验采用的SMC为第2～6代细胞。
1.2 条件培养液(CM)收集
为了获得CM，将两种细胞分别种植于24孔培养板中(EC和SMC分别为105/孔)，加入含10%新生牛血清的1ml DMEM培养液。细胞培养过夜后即牢固地贴附在每孔的底部形成单层。第二日，用无血清的DMEM培养液清洗孔内的EC或SMC各四次。在第3次和第4次冲洗的间隔中，将细胞在无血清的DMEM培养液、37℃条件下培养3小时，以便更完全地去除血清蛋白。在4次冲洗完成后，1ml无血清DMEM培养液加入到EC或SMC培养的孔中。其中部分EC的培养板孔中，加入含10μ mol/l Phosphoramidon的1ml无血清DMEM培养液。在继续培养24小时后，ECCM或SMCCM加入到培养细胞中以测定其对细胞增殖的影响。
1.3 ET-1和Phosphoramidon
在体外条件下，测定内皮素对SMC增殖的刺激作用时，应用的是合成的内皮素-1(ET-1，Fluca 公司)。ET-1溶液是将其溶解于无血清的DMEM培养液中配制而成。其用于SMC增殖试验浓度介于0.01pg/ml和100pg/ml之间。将含Phosphoramidon(10μ mol/L)的ECCM加入到培养的SMC中，以估计ECCM中ET-1对SMC生长的作用。
1.4 细胞增殖的测定
细胞增殖的测定是采用常见的3H掺入法。简要地说，分别将EC和SMC用胰蛋白酶消化后，接种在96孔板中(104/孔)，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液(100μl/孔)。细胞培养过夜后，类似于收集条件培养基一样，用无血清DMEM培养液连续冲洗4次。冲洗完成后，ECCM加入到SMC培养系统中。同理，SMCCM加入到EC培养系统中，细胞培养于微孔中，37℃条件下培养3天。所选择的培养时间是按Leszczynski等报导的〔2〕。在培养第3天之前的最后6个小时内，将〔3H〕-TdR(3.7kBq/104个细胞)分别加入到EC和SMC培养系统中。当培养期终止时，冲洗微孔中的细胞，在β计数器中收集并记数。
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