丹参对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响及增殖抑制初探
张玄 李世荣 李荟元 罗向东
摘 要：目的 探索丹参治疗增生性瘢痕的机理。方法 将培养的增生性瘢痕成纤维细胞加入含丹参的培养液中培养24h，与未加药者对照比较。结果 ①含丹参组成纤维细胞由长梭形变为圆形，而培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性及MTT(四甲基偶氮唑)比色法结果，用药组与对照组均无显著差异(P＞0.05)；②流式细胞仪检测各时相细胞DNA水平：用药组G0+G1期细胞的百分比明显高于对照组(P＜0.01)，而G2+M期百分比则显著低于对照组(P＜0.01)。结论 丹参能改变增生性瘢痕成纤维细胞形态，而不影响其活力并抑制其增殖。
关键词：丹参 增生性瘢痕 成纤维细胞
Effects of Salviae Miltiorrhizae on the morphology of hypertrophic scar fibroblast and initial exploration on the inhibition of proliferation
Zh ang Xuan, Li Shirong, Li Huiyuan，et al.
Department of Plastic Surgery, Southwes t Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038
Abstract Objective To explore the possible mechanism of S alviae Miltiorrhizae (SM) in the treatment of hypertophic scar (HS).Me thods Put the cultured HS fibroblasts derived from patients into the culture fluid containing SM for 24 hours, and then compare with the control gro up without SM.Results The spindle-shape cells were discovered becoming retraction and round. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and MTT ass ays showed no significant difference between the two groups (P＞0.05). The percentage of the DNA level in the G0+G1 phase, analyzed by the means of flowing cytometry, was higher than in the control group (P＜0.01), while in the G2+M phase the percentage in the for mer group was lower than the control group(P＜0.01) .Conclusion The SM can cause the alteration in cell morphology of H S fibroblast without damaging its viability, and also can exert an inhibitory effect on fibr oblast proliferation.
Key words：Salviae miltiorrhizae Hypertrophic scar Fibroblast
以胶原过度沉积为特征的增生性瘢痕，由于发生机理不明尚缺少有效疗法［1，2］。近年来，中药治疗增生性瘢痕备受关注，疗效比较肯定［3］，其中活血化瘀药物丹参的使用率较高，主要为临床应用，基础研究较少。为此，我们通过观察丹参对体外培养增生性瘢痕成纤维细胞的作用和影响，以探索其疗效机理。
材料和方法
一、材料
1.标本：取自我科住院病人手术治疗时切除的增生性瘢痕(经病理组织学检查确诊)。要求条件为：瘢痕处于增生活跃期，无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，无心、肺、肝、肾等慢性疾病，3个月内未使用类固醇激素类药物、青霉胺、抗肿瘤药物等，且未曾接受放疗者。年龄15～45岁。男性2例，女性1例。病程为烧伤后6～7个月。
2.主要试剂及仪器设备
MEM培养基(Sigma公司)，医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ-875型)，二氧化碳培养箱(美国SHEL-LAB1815TC型)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂XSJ-D型)，流式细胞计数仪(BecksonDicksonLnc.美国)。
二、方法
1.成纤维细胞培养［4］
将手术取材在无菌条件下用平衡盐液漂洗，分别剪去皮下组织和表皮，将真皮用眼科剪反复剪成0.5～1mm3的组织碎块，放入培养皿留置30min，待组织块干躁并贴附于培养皿表面，缓慢加入适量含15%小牛血清的MEM培养液，在37℃、5%CO2和95%空气的饱和温度条件下孵育，静置培养3～4天后换液，以后每2～3天换液1次。待成纤维细胞从组织大批长出，并融合或接近融合后，用0.25%胰蛋白酶消化法进行细胞传代。5～6天传代1次，传至第3代后将细胞保存于液氮中，实验前复苏备用。实验所用细胞为第4～8代细胞。
2.丹参对成纤维细胞的影响：以不加丹参者为对照
①药物实验浓度的确定［5，6］：以2×103个/孔密度接种细胞于96孔塑料培养板上，24h后，吸弃原培养液，分别将含稀释成不同浓度的丹参注射液(上海第一制药厂，批号951201)的培养液加入孔中。每个样本设3个复孔。继续培养72h后收样，用血球计数板分别计细胞数，以不含药物者为对照孔，计算药物对成纤维细胞抑制率。取抑制率50%的药物浓度为实验浓度。
抑制率=(对照孔细胞数—给药孔细胞数)/(对照孔细胞数)
②细胞形态学观察：在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。
③培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定［5］：以8×104个/孔密度接种细胞于24孔板上，24h后吸除原培养液，加入含实验浓度丹参的培养液2ml，继续培养24h，收集培养上清，以BeckmanCX7生化仪测定LDH活性。
④MTT比色法评定细胞存活状况［7］：96孔板上以2×104个/孔密度接种细胞，培养至细胞生长融合后，吸弃原培养液，每孔加入含丹参的培养液100ml，继续培养24h，加入5mg/ml的MTT20μl，培养4h后，每孔加入100ulSDS，静置12～16h，在酶标仪上检测波长为570nm的光密度值。测定值分别减去只含丹参培养液、MTT、SDS孔的光密度值，以消除药物本身颜色的影响。
⑤细胞DNA周期的测定：以5×105个/瓶密度接种细胞于50ml培养瓶中，培养24h，倒弃原培养液，加入含丹参的培养液，继续培养24h，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集，以流式细胞仪检测各时相的DNA水平。
结 果
一、抑制率50%时药物浓度为7.5mg/ml，故以此设定为实验浓度(表1)。
表1 不同浓度丹参对成纤维细胞的增殖抑制率
浓度(mg/ml) 150 30 15 7.5 3.75 1.875 0.937 0.469
抑制率(%) 57。95 55.07 53.62 51.17 40.58 26.09 11.59
8.69
二、对照组：可见典型长梭形成纤维细胞，细胞走向趋于一致，多呈平行排列并有一定孤度。高倍镜下可见长梭形细胞中央有圆形或卵圆形核，部分细胞可见向外伸出2～3个长短不一的突起。丹参组则见细胞数目减少，细胞形态出现明显改变。用药5～6h后细胞形态开始发生改变。可见梭状突起回缩，与邻近细胞接触减少，细胞双极变得尖细，有的只剩细单极。随着胞浆收缩，细胞极性消失，细胞变小，外形更趋向于球状，与邻近细胞接触消失。细胞核为圆形，密度与胞质有明显可见的区别。胞质内颗粒明显。可见部分细胞脱落，呈串状或单个悬浮于培养液中。胎盘蓝染色发现变形的细胞未着色(见图1～6)。
图1 未加药对照组成纤维细胞呈长梭形，相互接触紧密，平行排列 (苏木精染色)×480
图2 加药5～6h后可见细胞梭状突起开始回缩，与邻近细胞接触减少(苏木精染色)×480
图3 细胞外形趋向球形，细胞变圆，大多数细胞与邻近细胞接触消失(苏木精染色)×480
图4 未加药对照组成纤维细胞呈长梭形，相互接触紧密，平行排列(苏木精染色)×240
图5 加药5～6小时后可见细胞梭状突起开始回缩，与邻近细胞接触减少(苏木精染色)×240
图6 细胞外形趋向球形、细胞变圆，大多数细胞与邻近细胞接触消失(苏木精染色)×240
三、丹参作用24h后，培养上清中LDH活性与对照组之间比较，结果无显著差异(P＞0.05)(表2)。
表2 培养上清中LDH活性(IV/L)
组别 例数 LDH(±s)
对照组 8 17.00±5.72
丹参组 8 16.00±4.18
无显著差异(P＞0.05)
MTT比色法A570nm值用药组与对照组之间无明显差异(P＞0.05)(表3)。流式细胞仪测定DNA周期结果显示丹参组G0+G1期的细胞百分比明显高于对 照组(P＜0.01)，而G2+M期的细胞百分比则显著低于对照组(P＜0.01)(表4)。
表3 MTT比色法结果
组别 例数 A570nm±s
对照组 8 0.133±0.046
丹参组 8 0.111±0.027
无显著差异(P＞0.05)
表4 丹参对细胞DNA周期的影响
组别 例数 G0+G1(%)
S(%)
G2±M(%)
对照组 5 77.32 9.64±0.95 13.04±0.73
丹参组 5 86.10±2.76* 10.76±2.05 3.14±0.71#
与对照组存在显著差异(P＜0.01)
讨 论
丹参是中医临床常用药，常用于治疗增生性瘢痕的方剂中，丹参液病灶内注射治疗也有成功报道。但疗效机理尚少见研究报道。我们研究发现，体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，加入含有丹参的培养液后，细胞收缩，由长梭形变为圆形，有的贴壁细胞可发生脱落。为了解细胞形态改变后，是否出现坏死、溶解，我们测定了培养上清中的LDH活性。LDH为所有细胞的胞浆内均存在的细胞内酶，一旦细胞膜受损，LDH即迅速释放到细胞外，故可作为细胞毒性检测的一项敏感指标。结果显示，丹参组LDH活性与对照组无显著差异，说明丹参对成纤维细胞的作用方式非导致坏死。进一步以MTT比色法测定细胞存活状况。它能被活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶还原成黑色甲月 赞结晶。而死亡细胞则无上述反应。在细胞数量相同情况下，丹参组与对照组MTT比色法A570nm值无显著差异。说明丹参作用于成纤维细胞后，并不改变细胞存活情况，也无细胞损伤作用。通过流式细胞仪检测丹参作用后的成纤维细胞DNA周期变化，发现丹参作用后，G0＋G1期的细胞百分比明显高于对照组，而G2+M期细胞百分比却显著低于对照组，证明丹参能使分裂期细胞减少，令静止期细胞增多，从而抑制了增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。
可初步认为，丹参一方面可直接抑制成纤维细胞的增殖，另一方面可影响成纤维细胞的细胞骨架，使细胞形态发生改变。故可望以丹参治疗增生性瘢痕有临床应用前景。Ehrlich［8］、Aggeler［9］等人通过抗微管药物秋水仙碱、细胞松弛素B等对成纤维细胞作用影响的研究证明：凡能致成纤维细胞变圆的试剂或条件，均可增加胶原酶合成率和抑制胶原合成。丹参使增生性瘢痕成纤维细胞变圆后是否也产生上述结果?有待更进一步的研究。
作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院整形美容科(张玄，李世荣，李荟元)；烧伤研究所(罗向东)
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