冷冻伤性脑水肿的发生机制及尼莫地平治疗作用的实验研究
陈立华 杨于嘉 刘运生 何正文 秦天森 马建荣 陶永光 曹美鸿
【摘要】 目的 研究大鼠冷冻伤性脑水肿不同时间脑组织伊文思兰(EB)、突触体内［Ca2+］i及Ca2+-ATP酶活性变化与脑含水量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制和类型。方法 干湿法测定脑组织水分含量,甲酰胺法测定EB含量,Fura-2/AM荧光标记法测定突触体内［Ca2+］i,微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性。采用尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、［Ca2+］i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。结果 冷冻伤后30分钟即已发生Ca2+超载,伴随Ca2+-ATP酶活性下降及脑组织水分含量及EB含量增加。尼莫地平治疗后EB含量和［Ca2+］i明显下降,而Ca2+-ATP酶活性明显恢复,脑水肿明显减轻。结论 BBB的通透性增加和细胞内钙通道开放,钙离子浓度超载在脑水肿的发生与发展过程中起了重要作用。冷冻伤性脑水肿在早期既有细胞毒性脑水肿,又有血管源性脑水肿,即混合性脑水肿。
【关键词】 冷冻伤 脑水肿 伊文思兰 游离钙离子 尼莫地平 Ca2+-ATP酶
Experimental Study of Mechanism of Brain Edema and Effects of Nimodipine on Brain Edema Following Freezing Injury CHEN Li-hua, YANG Yu-jia, LIU Yun-sheng, et al. Dept. of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Aim To elucidate the mechanism and types of brain edema induced by freezing injury (FI). Methods ［Ca2+］i was determined in calcium fluorescent in Fura-2/AM loaded neuronal synaptosomes by using mono-wavelength spectrofluorophtometer. The Ca2+-ATPase activity was determined by biochemical method. Nimodipine was employed to show its effects on EB and WC of brain tissues, and on the ［Ca2+］i in the synaptosomes and alteration of Ca2+-ATPase activity in the mitochondrial. Results Neurons had calcium overload at 30 minutes after FI. The level of WC and EB of brain tissues, and ［Ca2+］i significantly increased in the freezing cerebral hemisphere in the FI group as compared with that of the sham-operation group at 30 minutes (P<0.05). In the contrast, the activity of mitochondrial Ca2+-ATPase decreased remarkably after FI (P<0.05). There was close positive relationship between ［Ca2+］i and WC. But there was negative correlation between ［Ca2+］i and Ca2+-ATPase. Conclusion It is suggested that the changes of the permeability of blood brain barries (BBB), ［Ca2+］i and Ca2+-ATPase may participate in the pathogenesis of brain edema. Nimodipine through inhibiting the excess of Ca2+ influx, stimulating the activity of Ca2+-ATPase, and decreasing significantly ［Ca2+］i and the permeability of BBB and possess the protective effect on brain edema induced by FI.
【Key words】 Freezing injury Brain edema Evan blues Cytosolic free calcium Nimodipine Ca2+-ATPase
脑水肿的发生机制尚不完全清楚,关于脑水肿发生的学说众多,较为公认的有兴奋性氨基酸和钙离子内流学说。笔者采用大鼠冷冻伤性脑水肿模型,分别测定该脑水肿模型不同时间含水量和伊文思兰(EB)含量的变化,观察脑水肿发生的时间过程和血脑屏障(BBB)通透性改变及二者之间的相互关系;荧光标记法检测突触体内［Ca2+］i及微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性变化的时相规律及与脑组织水分含量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制并明确其类型。在此基础上,采用L-型钙离子通道阻滞剂尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、［Ca2+］i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。
材料与方法
一、动物分组及模型制作
健康SD大鼠,共68只,雌雄不分,体重(210±30)g。随机分为:(1)空白对照组(Nor,鼠数=8),不作任何处理。(2)假冷冻伤组(Sham,鼠数=15),左顶开颅,硬膜外37℃假冷冻5秒钟。(3)冷冻伤组
(FI,鼠数=24),左顶开颅,硬膜外-50℃单点冷冻5秒钟。(4)尼莫地平治疗组(Nim,鼠数=21),-50℃硬膜外冷冻5秒钟后,于5分钟内经腹腔注射尼莫地平(德国Bayer公司提供,0.25mg/kg)。24小时Nim治疗组于冷冻伤后每8小时重复注射相同剂量的尼莫地平(共3次)。除空白组外,每1组又分为30分钟、4,24小时3个时间亚组。
二、实验方法
1.脑组织水分含量及伊文思兰(EB)含量测定:大鼠观察至规定时间后断头处死,干湿法测定脑组织含水量,按Ellit公式计算:脑含水量(WC,%)=(湿重-干重)/湿重×100%。EB含量测定采用甲酰胺法,具体操作步骤见文献［1］。
2.突触体和线粒体的制备:以不同浓度蔗糖梯度差速离心法分离出脑突触体和线粒体。突触体和线粒体的制备是本研究的关键步骤,因为它们的好坏直接影响测定结果,具体步骤和方法,见文献［2，3］。突触体和线粒体制备后须经透射电镜检测其存活程度和纯度,要求其纯度在85%以上。
3.突触体［Ca2+］i和线粒体Ca2+-ATP酶活性测定:线粒体Ca2+-ATP酶活性测定采用微量定磷法［2］。采用日立-850型荧光分光光度计测定突触体的荧光强度［3］。根据下式计算出［Ca2+］i
［4］。
［Ca2+］i=Kd×［F(F-Fmin)/(Fmax-F)］
式中Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数,Kd=224nm。
三、统计学分析
测定值用均数±标准差(±s)表示,均数比较采用方差分析和直线回归相关分析。全部资料用SPSS软件在计算机上分析。
结 果
一、冷冻伤后脑组织含水量与EB含量变化
FI各时间亚组脑含水量及EB含量均明显高于相应时间Sham组,差异有显著性(P<0.05)。FI组脑含水量与EB含量呈正相关关系,二者具有高度的相关性(r≥0.85,P<0.05)。见表1。应用尼莫地平治疗后,脑含水量及EB含量均明显降低(P<0.05)。
表1 大鼠冷冻伤后脑组织含水量及EB含量的变化(±s)
组别 伤后时间 鼠数 含水量(%) EB(μg/g) r(P值)
正常对照组 8
78.28±0.34
1.22±0.22
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