白介素-1及地塞米松对人髁状突软骨细胞增殖、代谢及前胶原基因表达的影响
焦岩涛 王大章 胡静
摘 要：目的 观察白介素-1(IL-1)及地塞米松对人下颌骨髁状突软骨（MCC）细胞增殖、代谢及前胶原基因表达的影响。 方法 采用体外细胞培养、同位素掺入及狭缝杂交方法。 结果 IL-1具有抑制细胞增殖及胶原蛋白合成的作用，地塞米松一方面可促进细胞增殖，但同时却抑制了其胶原合成。二者在对前胶原基因表达影响方面作用相似，均可显著抑制软骨特征性的Ⅱ型胶原基因表达(分别为对照组的48.6%和57.9%)，而提高非软骨的Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达。 结论 IL-1对MCC细胞分化、增殖及胶原合成的抑制作用可能是它在骨关节病发病中重要的致病途径之一。地塞米松具有一定促进细胞增殖的作用，但鉴于其对软骨细胞胶原合成及Ⅱ型胶原基因表达的抑制，提示临床上应用不当可能会诱发或加重骨关节病及软骨损害。
关键词：髁状突； 细胞，软骨； 白细胞介素-1； 地塞米松
Effect of IL-1 and dexamethasone on proliferation, metabolization and precollagen gene expression of
human condylar cartilage cells
JIAO Yantao, WANG Dazhang, HU Jing.
（Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081, China）
Abstract：Objective To examine the effect of IL-1 and dexamethasone on proliferation, metabolization and precollagen gene expression of human mandibular condylar cartilage(MCC) cells. Methods MCC cells of human fetus were cultured in DMEM supplemented with 10% of new born calf serum and incorporation isotope and mRNA slot-blot hybridization. Results IL-1 significantly inhibited MCC cells' proliferation and collagen synthesis. Dexamethasone promoted proliferation, but it suppressed the collagen synthesis. The two had similar effect on precollagen gene expression, ie inhibiting type Ⅱ collagen gene expression of cartilage but promoting type Ⅰ and type Ⅲ collagen gene expression of non-cartilage. Conclusions The inhibitory effect of IL-1 on chondrocyte differentiation may be one of its pathogenic pathways implicated in osteoarthrosis (OA). Although dexamethasone has some positive effects on cells proliferation, its inhibitory effect on collagen synthesis and type Ⅱ collagen expression of cartilage cells suggests that it may induce or exacerbate the destruction of articular cartilage if they are used inappropriately.
Key words：Mandibular; Cells, cartilage; Interleukin-1; Dexamethosone▲
以往研究显示，在骨关节病（osteoarthrosis，OA）发病及进展过程中，细胞因子白介素-1(IL-1)，IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等均起着重要作用。尽管目前尚不能确定它们是OA的发病因素，还是其病变过程中的产物，但细胞因子水平与骨关节病病变程度有着密切联系［1，2］。糖皮质激素是临床上常用的骨关节病治疗药物，但其治疗价值存在争议。二者对关节软骨的确切作用目前尚不清楚。笔者利用体外细胞培养、同位素掺入及狭缝杂交方法，研究IL-1及地塞米松对人髁状突软骨(MCC)细胞增殖、代谢的影响及对几种重要的间质型胶原即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的调控作用，以期为骨关节病、软骨损伤的发病机制的研究，以及临床合理应用激素治疗OA与关节损伤提供理论和实验依据。
材料与方法
一、人胚髁状突软骨细胞分离培养
参照文献［3］，髁状突软骨取自因健康原因而终止妊娠的4～6个月龄水囊引产的人胚胎。经机械分离及胰蛋白酶、胶原酶联合消化获得，接种于DMEM培养基，内含体积分数为10%的小牛血清，常规条件下培养。
二、IL-1及地塞米松对人髁状突软骨细胞增殖及胶原蛋白合成的影响
取对数生长期的第2代人髁状突软骨细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，定量接种于96孔板。待细胞贴壁后，更换为无血清DMEM培养基培养24 h，使细胞相对同步化。然后更换含IL-1（0.1，1，10，100 ng/ml）或地塞米松（0.1，1，10，100 μg/ml）的培养基，同时各样品孔加入 3 H-TdR或 3 H-proline(终浓度为185 kBq/ml)继续培养至预定时间，多头细胞收集器将细胞抽滤、点样于“49型”玻璃纤维滤纸。液体闪烁谱仪测定各样品的min-1值。
三、IL-1及地塞米松对人髁状突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ前胶原基因表达的影响
取培养的第2代软骨细胞，以1×105/ml密度接种于T125 ml培养瓶。待细胞长满汇合成单层时(约为2×106)，更换培养基，分别加入不同的实验因素，继续培养24 h。实验分组为：空白对照组、IL-1(10 ng/ml)组、地塞米松(100 μg/ml)组，每3瓶细胞为一组。
1. 人髁状突软骨细胞RNA的提取、鉴定：采用RNeasy 试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度计A260/A280，确定RNA的纯度和含量，大于1.8表明纯度较好。经甲醛变性凝胶电泳鉴定，28S及18S条带清晰，所获RNA具较好完整性。
2. Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原cDNA探针的提取、标记：各型重组质粒经转化、鉴定，大量扩增，碱裂解法抽提，限制性酶切消化后，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收特定cDNA片段。探针标记按地高辛标记试剂盒说明进行。
3. 狭缝杂交及密度扫描：取适当大小的尼龙膜，取各样本RNA，依次等倍稀释，即4，2，1 μg，上样抽滤。置120℃真空烤箱内30 min，使样品RNA与尼龙膜发生交联。将点样的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液4 ml，50℃水浴保温2 h。更换杂交液（含50 pg/ml已变性的特定cDNA探针），50℃恒温杂交过夜。杂交后，以2×SSC，质量浓度为1 g/L的 SDS；0.1×SSC，质量浓度为1 g/L的SDS依次洗膜。在抗地高辛抗体 (150 mU/ml)溶液中孵育30 min，将杂交膜转移至3 ml显色液中，暗室内室温孵育16 h。用马来酸缓冲液终止反应。干燥后，进行灰度扫描。
四、统计学处理：实验结果均以±s表示，采用t检验确定组间差异。
结 果
一、IL-1及地塞米松对人MCC细胞增殖及代谢的作用
IL-1在0.1～100 ng/ml浓度范围内呈剂量效应关系地抑制MCC增殖及胶原合成。地塞米松在1～100 μg/ml浓度范围内，一方面可促进细胞增殖，另一方面却抑制其胶原蛋白合成。结果详见表1。
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