急性脊髓损伤后脊髓组织内皮素-1mRNA表达的实验研究
鲁凯伍 侯铁胜 傅强 蒋应明
摘 要：目的 探讨内皮素-1(ET-1)在急性脊髓损伤中的表达及其作用机制。 方法 应用35 g负荷压迫大鼠胸段脊髓(T8～9) 5 min，造成大鼠胸段脊髓急性中度损伤；借助原位杂交组织化学方法，定位、定量研究大鼠急性脊髓损伤后早期ET-1 mRNA表达的时间和空间分布特征。结果 脊髓压迫伤后30 min ET-1 mRNA表达明显增多，4 h达最高峰，一直持续至72 h恢复至正常水平。ET-1 mRNA表达阳性细胞主要是神经元细胞，高表达区在脊髓前角(Ⅸ区）。 结论 伤后脊髓组织中ET-1含量增多的主要原因之一是由于其转录水平的异常表达,ET-1是脊髓继发性损伤的重要损害因子。
关键词：脊髓损伤； 内皮素－1； 核糖核酸，信使； 原位杂交
Experimental study on expression of endothelin-1 mRNA in spinal cord tissues from acute spinal cord injury
LU Kaiwu, HOU Tiesheng, FU Qiang, et al.
（Dept. of Orthopedics, Changhai Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200433, China）
Abstract：Objective To explore mRNA expression and action mechanism of endothelin-1(ET-1) in spinal cord injury (SCI). Methods The thoracic spinal cord (T8-9) of rats was compressed by a load of 35 g for 5 minutes,which caused an acute and moderate injury.By means of in situ hybridization histochemistry (ISHH), the distributive particularities in time and location of the early expression of ET-1 messenger ribonucleic acid (ET-1 mRNA) in injured spinal cord tissues from rats were qualitatively and quantitatively measured. Results The expression of ET-1 mRNA increased 30 minutes after spinal cord compression and reached its climax at 4 hours. Then, it decreased slowly to normal level at 72 hours.The positive cells of the ET-1 mRNA expression were localized to neuronal cell bodies in spinal cord. The highly expressive regions were in the ventral horn (laminae IX). Conclusions An increase of ET-1 concentration in injured spinal cord tissues is mainly from its abnormal expression of transcription level. ET-1 is a key injury factor in secondary injury after acute spinal cord injury.
Key words：Spinal cord injury; Endothelin-1; RNA, messenger; In situ hybridization▲
初步证实，内皮素(ET)作为一种重要的神经肽在体内发挥着广泛的生物学效应,同时也发现ET参与了多种出血性和缺血性脑损害的形成。近年来，在脊髓损伤早期也发现ET表达增多，但对其机制研究报道极少。笔者研究大鼠急性脊髓损伤后早期ET-1 mRNA表达特征,旨在探讨ET-1在继发性脊髓损伤中的作用机制。
材料与方法
1. 实验动物分组:健康雄性SD大鼠60只,体重（350±20）g，随机均分为10组 ：正常组；对照组（单纯行T8～10椎板切除）；脊髓损伤后0.5，2，4，8，12，24，48，72 h组。
2. 损伤模型的制备及取材：采用Nystrom等［1］法从后路压迫脊髓：用质量浓度为60 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg/kg)，分离、咬除T8～10椎板，暴露出T8～9，保持硬脊膜完整。固定两端棘突。通过一2.2 mm×5 mm弧形金属垫片压迫T8～9脊髓后侧，压迫重量为35 g，时间5 min，造成脊髓中度损伤。取材：按分组时间将大鼠麻醉后开胸，行胸主动脉插管灌注。先灌注50 ml灭菌等渗盐水，然后灌注250 ml质量浓度为40 g/L的多聚甲醛和3 g/L的饱和苦味酸混合液，维持20 min后完整取出脊髓组织，后固定6～12 h。再入质量浓度为200 g/L的蔗糖和40 g/L的多聚甲醛混合液中脱水。伤段脊髓行连续冠状切片，厚50 μm，固定4～6 h。
3. 原位杂交：(1)探针合成:将含有大鼠ET-1cDNA序列编码区的质粒PCR 1000 (Yanagisawa博士馈赠)转化入HB101大肠杆菌(Promega公司，美国)后大量扩增，经EcoRⅠ酶切后制成线性DNA模板。采用T7 RNA聚合酶(Promega公司)体外转录，RNA地高辛随机引物标记盒（Boehringen Mannheim公司，美国）标记制成反义ET-1 cRNA探针。(2)原位杂交:采用飘染法。①切片预处理:切片依次入下列溶液漂洗:0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS) 5 min×3次，0.1 mol/L甘氨酸/PBS 5 min，质量浓度为4 g/L的 Triton X-100/ 0.1 mol/L PBS 15 min，1 μg/ml蛋白酶K 37℃水浴30 min，质量浓度为40 g/L的多聚甲醛PBS 5 min，0.1 mol/L PBS 3 min×2次，质量浓度为2.5 g/L的乙酸酐 10 min，2×SSC 10 min。②杂交及显色:切片用灭菌滤纸吸干后入杂交液中（探针含量0.5 μg/ml），43℃杂交12～16 h。将切片依次挑入4×SSC、2×SSC（含RNA酶 A，20 μg/ml）、1×SSC、0.5×SSC 37℃漂洗15 min，再入0.05 mol/L PBS漂洗5 min×3次。吸干后入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(1∶1 000)稀释液中，室温放置4 h。用0.05 mol/L PBS冲洗5 min×4次，TSM1 15 min×2次，TSM2 25 min×2次。最后入硝基四氮唑蓝(NBT)和5-嗅，4-嗅，3-吲哚基-磷酸(BCIP)显色液中，室温避光显色3 h。常规贴片封片。
4. 结果判定及统计学处理：ET-1 mRNA杂交阳性细胞胞浆内含有紫蓝色颗粒。每组任选10张切片，计算机图像分析仪(中国科学院自动化研究所)上由未知实验细节者计算脊髓前角阳性颗粒灰度和面积。所有数据用±表示，采用t检验行统计学处理。
结 果
正常组、对照组T7～8灰质神经元胞浆内可见淡紫蓝色阳性颗粒。前角Ⅸ区大多极神经元胞浆内着色较深。后角Ⅰ～Ⅲ区未见阳性细胞。Ⅳ～Ⅵ区及中央管周围Ⅹ区见中等量杂交阳性神经元。在非神经元细胞，包括胶质细胞和星形细胞，未见阳性信号。白质中无着色。灰质中偶见阳性血管内皮细胞表达。见图1，2。损伤组T7～8灰质中ET-1 mRNA表达明显增多，主要表现为数目增多，着色变深。非神经元细胞及白质中未见阳性表达，后角Ⅰ～Ⅲ区见少量阳性细胞表达。损伤后0.5 h即有明显表达增多，主要表现在前角（Ⅸ区）。见图3，4。经统计学处理，前角阳性颗粒灰度和面积与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。损伤后4 h ET-1 mRNA表达达高峰(P<0.01)，48 h仍有明显升高(P<0.05)，至72 h趋于正常水平。正常组与对照组比较无明显差异。
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