冷冻同种异体肌腱小鼠移植的细胞毒、IL－2水平及组织学观察
鲁晓波 杨志明 张郁馨
【摘要】 目的 了解冷冻同种异体肌腱移植术后宿主的免疫排斥反应。方法 采用BALB/C小鼠肌袋模型，植入冷冻C57小鼠跟腱，观察术后各期宿主血清微量细胞毒性、局部组织浆IL-2水平和局部组织学变化。结果 (1)经冷冻/冻干处理组淋巴细胞毒性、IL-2活性显著低于未处理组(P＜0.01)，但仍高于自体组(P＜0.01)。(2)处理各组间细胞毒性无差异(P＞0.05)，而IL-2活性-196℃组高于其他组(P＜0.01)。(3)各组局部组织淋巴细胞浸润程度与细胞毒反应相符。结论 经冷冻/冻干处理后，同种异体肌腱移植免疫排斥反应显著降低，但未消失。
【关键词】 移植，同种 移植免疫学 腱 细胞毒性，免疫 白细胞介素-2 组织学
An Investigation of Cytotoxicity, IL-2 and Histology Following Frozen Allografts Tendons in Mice
LU Xiaobo*, YANG Zhiming, ZHANG Yuxin.
* Dept. of Orthopedic Surgery, Luzhou Medical College, Luzhou 646000
【Abstract】 Objective In order to investigate the immune rejection response of host to the implanted achilles tendon allografts of C57 mice in BALB/C mice model. Methods The dryly frozen, deeply frozen (-196℃) and frozen (-80℃) achilles tendons of C57 mice were respectively treated as Group A,B,C while fresh tendons allografts served as positive control (Group D) and autografts as negative control (Group E). Immunologic and histologic characters were observed at 2, 7, 14, 28, 42 days, separately. Results (1) The contents of lymphocytotoxicity and IL-2 showed markedly lower in Group A,B,C than in Group D (P<0.01), but were still higher than in Group E. (2) The IL-2 level was significant difference (P<0.01) between Group B and A or C. (3) The histologic immuneresponse in Group A,B,C abated more greatly than in Group D, but the local tissue was still infiltrated by monocytes and lymphocytes. Conclusions The immune rejection response is abated markedly but does not disappear in the treated achilles tendons of allografts.
【Key words】 Transplantation, homologous Transplantation Immunology Tendon Cytotoxicity, immunologic Interleukin-2 Histology
同种异体肌腱移植的临床应用日益受到重视，但对其植入后的免疫反应报道不一。笔者进行了如下实验，以观察经冷冻/冻干处理的同种异体小鼠跟腱在宿主体内的免疫排斥反应。
材料与方法
一、主要仪器
自动恒温CO2培养箱，可控温深低温冰箱(德国),真空冷冻干燥机(日本)，倒置相差显微镜，微量反应盒(Terasaki板,96孔,美国Corning公司)，液氮储存容器,显微手术器械,全自动酶免分析仪(美国Auraflex公司)。
二、溶液
1.试剂：Hanks液，体积分数为10％的新生小牛血清(FCS)，RPMI1640培养液,PHA溶液,淋巴细胞分离液,兔补体,医用液体石蜡，质量浓度为83 g/L的Tris－NH4Cl液，酸化异丙醇，质量浓度为50 g/L的伊红水溶液，MTT染色液。
2.CTIL－2细胞株(华西医科大学免疫教研室赠)。
3.淋巴细胞悬液制备：取C57小鼠的脾脏,用100目不锈钢筛研磨制成单个细胞悬液，用质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl除去红细胞。提取细胞悬液5 ml,加入1/2的淋巴细胞分离液,离心2 000 r/min 15分钟,再用体积分数为10％的FCS－RPMI1640将细胞浓度调至2×106/ml，置4℃冰箱备用。
4.局部组织匀浆上清制备：无菌条件下取植入局部组织块50mg左右，加入不完全RPMI1640培养液,用100目不锈钢筛研磨，离心，体积分数为10％的FCS－RPMI1640培养液调至细胞浓度2×106/ml，加PHA，37.5℃、体积分数为5％的CO2培养48小时，收集上清，－20℃冻存。
三、供体肌腱的处理
取C57近交系雄性小鼠(华西医科大学实验动物中心提供)50只，体重20g左右,断颈处死，在严格无菌条件下，切取双侧跟腱共100根，Hanks液(加庆大霉素100U/ml)反复冲洗后,低温保护剂DMSO及体积分数为10％的FCS浸泡10分钟，放入消毒玻瓶中待处理。
1.冷冻组：放入可控低温冰箱(下降1℃/h)降温至－80℃10天后，或再移至液氮储存器保存－196℃待用，分别制成－80℃和－196℃组，术前15分钟解冻。
2.冻干组：放入可控低温冰箱10天后，再置入真空冷冻干燥机处理至残余湿度1％左右，密封，术前3小时解冻。
四、动物模型及分组
取6～8周雄性BALB/C近交系小鼠90只，体重20g左右，随机分为5组，戊巴比妥钠腹腔麻醉，在小鼠双侧股后肌间隙分别植入冻干组(A)、深冷冻组(B)、冷冻组(C)、未经处理组(D)、自体移植腱组(E),术后2，7，14，28，42天无菌条件下取血清、局部组织块及组织匀浆上清液待用。
五、检测方法及步骤
1.微量细胞毒测定：采用Terasaki改良法［1］ 。在微量反应盒每孔加入5～10μl医用石蜡油，以防反应物蒸发，加入待检各组的受检血清1μl；加入细胞浓度为2×106 /ml的淋巴细胞悬液1 μl，轻轻振动，使血清与细胞充分混匀，另设阴性与阳性对照孔；置室温(22±2)℃30分钟；加入兔补体5 μl，置室温(22±2)℃60分钟；加入质量浓度为50 g/L的伊红溶液3 μl染色；加入体积分数为3％的甲醛8μl固定；静置2小时，轻轻吸去上清液，倒置相差显微镜下计数。死细胞(伊红染色)百分数按高于对照孔计算。
2.IL-2活性测定：采用细胞增殖MTT比色法［1］。将处于对数生长IL－2依赖细胞株CTIL-2用体积分数为10％的FCS－RPMI1640洗涤3次,离心，用体积分数为5％的FCS－RPMI1640调整细胞浓度为1×105 /ml,加入96孔反应板中,每孔100 μl;加入局部组织匀浆上清100 μl/孔；每份样品作复孔,另外作阳性(rIL－2标准)及阴性(培养液)对照；37.5℃、体积分数为5％的CO2培养24小时；加质量浓度为50 μg/L MTT溶液10 μl/孔；继续培养24～36小时；加酸化异丙醇100 μl/孔；充分振荡吹打后，静置20分钟，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析。
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