纤溶酶原激活剂及其抑制因子1在大鼠脊髓急性损伤时的表达
王德春 陈中伟 陈峥嵘 张乃娴 宋后燕
【摘要】 目的 观察大鼠脊髓急性损伤时组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）和纤溶酶原激活剂抑制因子1（PAI－1）表达的变化，了解t－PA、PAI－1在脊髓急性损伤后所起的作用。方法 35只Wistar大鼠，用改良Allen法制成脊髓中度急性损伤模型，伤后2，6，24，72，168，240小时取材分别进行组织学、免疫组化、图像分析。结果 脊髓中度损伤后，损伤部位脊髓经过了出血、血栓形成、液化、坏死等病理变化。脊髓损伤后3天t-PA表达达到高峰，以后逐渐下降，而PAI－1伤后3天有少量表达，以后逐渐增多。结论 t－PA、PAI－1参与脊髓急性损伤过程，PAI－1对保护残存的运动神经元及胶质细胞具有一定作用。
【关键词】 脊髓损伤 组织学，比较 大鼠 组织型纤溶酶原激活剂
Expression of Tissue-type Plasminogen Activator and Its Inhibitor-1 in Acute Rat Spinal Cord Injuries
WANG Dechun, CHEN Zhongwei, CHEN Zhengrong, et al.
Dept. of Orthopedic Surgery, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To observe the changes of tissue-type plasminogen activator (t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression in acute rat spinal cord injuries (SCI), to learn about the effect of t-PA and PAI-1 on the process of acute spinal cord injury. Methods Using thirty-five Wistar rats, the moderately acute spinal cord injury models were made with modified Allien's methods. Histology examination, immunohistochemistry and map analyses were performed after 2, 6, 24, 72, 168, 240 hours of injury. Results After moderately acute spinal cord injury, pathology changes such as bleeding, thrombosis, liquescence, necrosis, etc occurred in the local area of injured spinal cord. Immunohistochemistry and map analysis demonstrated that the expression of t-PA reached the maximum in 3 days of injury, and subsequently reduced; but only a small amount of PAI-1 was expressed in 3 days of SCI, and then increased gradually. Conclusions t-PA and PAI-1 participate in the process of acute spinal cord injury. PAI-1 has some effects on protecting the remnant motor neurons and gliocytes.
【Key words】 Spinal cord injury Histology, comparative Rats Tissue-type plasminogen activator
脊髓受到外力作用引起急性损伤，除原发性因素如机械作用外，继发性因素也起了非常重要的作用。如细胞外基质成分的改变，细胞因子的作用［1］，氧自由基、一氧化氮、一氧化氮合酶的作用［2］，一系列细胞外蛋白降解酶的作用，纤溶成分的改变等。笔者着重就纤溶成分中的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活剂抑制因子(PAI－1)在脊髓急性损伤时表达的变化及作用进行探讨。
材料与方法
一、 脊髓急性损伤模型的制作
取成年健康Wistar大鼠35只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为6组，每组5只。用质量浓度为3 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（1.0 ml/100 g），手术区脱毛，固定。消毒后显露胸腰段椎板，咬除T12～L1椎板，显露硬脊膜。在T13腰骶膨大处放置一直径3 mm、重0.1 g的铜片。用10 g法码，在直径为1 cm玻璃管的引导下从6 cm高处垂直落下打击铜片，冲量为60 gcf，致大鼠脊髓中度损伤。伤后2，6，24，168，240小时再次麻醉后，分别用等渗盐水和质量浓度为40 g/L的多聚甲醛心脏灌流，以打击点为中心取约1 cm长的伤段脊髓，放入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定液中，4℃固定约8小时，连续切片，分别行HE染色、免疫组化检查。
二、 免疫组化染色及图像分析
鼠抗t-PA和PAI-1单抗为上海医科大学分子遗传研究室惠赠；ABC复合物购于华美公司。采用ABC法，按照说明中的提示进行免疫组化染色，分别以家兔血清或PBS取代第1抗体作替代对照或空白对照。
在MIAS－300图像分析系统上，分别测定一定面积中的阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，每例测4个高倍视野，计算免疫组化阳性指数（PI）［3］。
结 果
一、 HE染色观察
脊髓损伤后2小时灰质内散在出血，6小时白质、灰质内灶性出血，灰质肿胀；24小时灰白质内片状出血，神经轴突浊肿变性，神经元固缩、变性、坏死、溶解，神经元间隙增大；7天神经元数量明显减少，残存神经元尼氏体开始增加，神经胶质细胞开始增多；10天脊髓灰质开始出现萎缩，神经纤维排列紊乱，胶质细胞较7天时无明显增多。
二、 免疫组化染色观察
正常大鼠胸腰段脊髓t-PA抗原呈弱阳性，且主要位于脊髓灰质和软脊膜，而PAI－1无明显表达，脊髓损伤2小时后t-PA免疫组化染色阳性反应逐渐增强，3天时达到高峰（图1）；以后又有所转弱，3天时软脊膜染色呈明显阳性，着色亦较深。PAI－1在脊髓损伤3天内免疫组化无染色，3天时略有染色（图2），以后逐渐深染，成局灶性，前角运动神经元、胶质细胞7天时明显深染（图3）。免疫组化对照切片无着色。
图1 脊髓损伤后3天前角运动神经元及胶质细胞
t-PA抗原强阳性反应 免疫组化 ×200
图2 脊髓损伤后3天前角运动神经元及胶质细胞
PAI-1抗原微弱阳性反应 免疫组化 ×400
图3 脊髓损伤后7天前角运动神经元及胶质细胞明显减少，
PAI-1抗原强阳性反应 免疫组化 ×200
t-PA与PAI－1免疫组化阳性指数（PI）随时间变化：脊髓损伤后72小时t-PA表达达到高峰，以后逐渐下降；PAI－1在伤后72小时有少量表达，以后逐渐增多，至168小时达到高峰，然后逐渐下降（图4）。
图4 t-PA与PAI-1免疫组化阳性指数(PI)的变化
讨 论
t-PA和PAI－1是纤溶系统中重要的调节因子，t-PA可激活纤溶酶原使其变化为纤溶酶，而PAI－1可抑制t-PA活性，对t-PA具有调节作用，从而影响整个纤溶系统。
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