细胞凋亡在颌骨骨折愈合过程中的发生及意义
司晓辉 金岩 杨连甲
一、材料与方法
1. 主要材料和试剂：健康成年雄性家兔（1.6～2.2 kg）24只，由本校动物中心提供；TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) kit购自美国Oncor公司。
2. 骨折模型建立及标本处理：用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠对家兔行全麻（1 ml/ kg），于家兔单侧下颌骨角前切迹处用牙科涡轮机造成完全性骨折，钢丝结扎固定，逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤。分别于术后第1，3，5，7，11，14，21和28天取材（每个时间点3只动物），取材前用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛灌注固定，然后取骨断端及其周围组织，4℃后固定4 h。常规脱钙，石蜡包埋，切片5 μm厚，HE染色。
3. TUNEL法检测细胞凋亡：切片脱蜡，PBS (14.5 g/L Na2HPO4.12H2O,1.48 g/L NaH2PO4.2H2O, 11.7 g/L NaCl, pH 7.5)洗5 min，蛋白酶K（20 μg/ml）37℃孵育15 min；PBS洗后，在体积分数为3%的 H2O2/ PBS中37℃孵育5 min；PBS洗后，加25 μl平衡缓冲液，37℃孵育1 min；加25 μl TdT酶，37℃孵育2 h后，加37℃预热的中止缓冲液，37℃孵育30 min，每10 min更换中止缓冲液 1次；缓冲液 A (12.11 g/L Tris-HCl, 8.78 g/L NaCl, pH 7.5)洗后，正常羊血清37℃封闭30 min；加Anti-DIG-AP，37℃孵育2 h；缓冲液A洗后,用缓冲液 B (12.11 g/L Tris-HCl, 5.85 g/L NaCl, 5.05 g/L MgCl2.6H2O, pH 9.5)洗5 min，NBT/ BCIP显色30 min，脱水，透明，封片。
二、结果
1. HE观察：骨折后第1天，骨断端间隙由血肿充填；第3天血肿开始机化，成纤维细胞、毛细血管芽长入血凝块，形成肉芽组织；第5 天，骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增生并逐渐向骨断端移行；第7 天，新生骨小梁明显增多，其外周可见成骨细胞；第11天，软骨岛增多，并可见肥大的软骨细胞。膜内成骨活跃，新生骨小梁基本覆盖骨断端；第14 天，骨小梁变粗大，形成骨髓腔，可见较成熟的骨组织；第21，28天，骨折处新骨连接成片，趋向于连接骨断端及封闭外界与骨髓腔的交通。
2. 细胞凋亡检测：阳性细胞的胞核呈紫蓝色颗粒。骨折后第1天，血肿区内偶见阳性细胞；第3天，阳性细胞有所增加；第5天，骨折部位细胞成分明显增多，凋亡细胞也较前增多；第7 天，在类似于发育的细胞凝聚区内凋亡细胞数增加，而新生骨小梁处偶见凋亡细胞；第11 天，软骨区内细胞皱缩，见较多的凋亡细胞；第14 天，凋亡细胞明显减少，新骨内可见少量骨细胞呈阳性；第21，28 天，新骨处于改建更新过程，偶见个别成骨细胞凋亡，与正常骨接近并趋于一致。
三、讨论
在颞下颌关节（TMJ）发育中，下颌髁状突的形态改变及关节下腔的发生均有凋亡参与，若凋亡过程被打乱，最终导致TMJ功能障碍或先天畸形［1］。骨组织生长、代谢和重建也与细胞凋亡密切相关。骨折修复时软骨痂内的软骨细胞通过凋亡而被清除［2］。骨折愈合时的细胞增殖和凋亡同时发生。成人股骨头和髂骨内未见明显的凋亡细胞，而儿童颅盖骨、成人异位骨和骨赘内则见典型的凋亡细胞，且婴儿骨和病理性骨凋亡细胞的分布不同，提示生理性和病理性骨凋亡的发生有差异。
检测细胞凋亡的方法以TUNEL法较为常用。TUNEL即末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP-X切口末端标记。TdT是一种DNA修饰酶，可催化在DNA片段3'-OH末端合成多核苷酸聚合物的反应，即DNA片段加尾。在此过程中，带有地高辛等标记物的单核苷酸（dUTP）掺入到加尾聚合物中，完成对DNA断裂缺口的标记。TUNEL法可在常规固定的细胞或脱矿的组织切片上进行原位标记，是一种简便、快速、灵敏度和特异性都较高的方法。笔者用此方法观察到，在骨折后第5 天和第11 天, 凋亡细胞明显增加。第5 天为骨折愈合的膜内成骨期，此时骨断端附近的细胞处于去分化状态，增殖明显。在细胞去分化达到高峰时，凋亡细胞也达到最多，提示细胞增生和凋亡这两个过程是协调发生的，而在细胞分化和成熟期，凋亡细胞数量也减少；第11 天处于软骨形成期，软骨细胞逐渐肥大退化，在这一时期无坏死发生，而是通过凋亡使得无用的软骨细胞从损伤部位被有序清除，为以后的软骨骨化作准备。
(本文编辑：蒋伟)■
作者单位：司晓辉（西安，第四军医大学口腔医学院病理科 710032）
金岩（西安，第四军医大学口腔医学院病理科 710032）
杨连甲（西安，第四军医大学口腔医学院病理科 710032）
参考文献：
［1］Matsuda S, Mishima K, Yoshimura Y, et al. Apoptosis in the development of the temporomandibular joint. Anat Embryol Berl, 1997， 196: 383-391.
［2］Lee FY, Choi YW, Behrens FF, et al. Programmed removal of chondrocytes during endochondral fracture healing. J Orthop Res, 1998， 16: 144-150.
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