脑干损伤早期白蛋白的免疫组织化学改变
邓 平 徐小虎 祝家镇 宋一璇
脑组织损伤后，血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）将受到破坏，血浆蛋白可从血液中达到血管周围的神经组织，甚至进入神经细胞胞浆［1］。笔者采用免疫组织化学方法观察脑组织中白蛋白（albumin，Al）在脑干针刺损伤后0.5～24小时的改变情况，探讨脑干损伤早期BBB和神经细胞的病理学改变，为进一步阐明脑干损伤后的机能改变提供实验依据。
一、材料与方法
1.主要试剂：Rabbit Anti-Human Al (DAKO); LSAB Kit (K9001 DAKO)。
2.实验动物及模型［2］：Wistar大白鼠48只，体重180～210 g，雌雄不限。随机分为脑干生前致伤组（0.5，1，3，6，15，24 小时），死后损伤组及正常对照组共8组，每组6只。用质量浓度为20 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50 mg/kg）。沿头正中线纵行切开头皮，暴露颅骨。生前致伤组：用5号针头从枕骨大孔后缘中点刺入（与冠状面呈30°）3 mm造成延髓损伤，分别于伤后0.5，1，3，6，15，24 小时剪破心脏处死，15分钟后取全脑；死后损伤组：先按上法处死，15分钟后用同样方法造成损伤，伤后1小时取全脑；正常对照组：不造成损伤，处死后15分钟取全脑。所有脑组织均放入10%中性福尔马林中固定16～18小时。
3.取材、HE染色及LSAB免疫组化染色：冠状切取大脑中部、中脑、脑桥及延髓共4个组织块，石蜡包埋，连续切片（8 μm）。HE染色按常规进行；LSAB染色按试剂盒提供的实验步骤进行。
二、结果
1. HE染色：生前致伤组可见广泛蛛网膜下腔出血，脑组织水肿，神经细胞及其突起肿胀；死后损伤组有少量蛛网膜下腔出血；正常对照组无明显病变。
2.Al免疫组织化学染色：(1) 正常对照组：Al阳性反应物仅位于血管腔内，呈团块状；血管周围神经组织呈阴性反应，各部位脑组织中均未见阳性细胞。(2)死后损伤组：除血管腔内有阳性物外，延髓中少数血管周围的组织间隙亦呈Al阳性反应，但各部位脑组织中均未见Al阳性神经细胞。(3)生前致伤组：脑干内血管周围的Al阳性物呈放射状分布，染色由近到远逐渐减弱。可见Al阳性神经元和神经胶质细胞，在延髓和脑桥较多，中脑极少。伤后0.5小时，大多数细胞的阳性物仅靠近胞膜呈环状；伤后1～3小时，胞浆中的阳性物增多，染色较强，呈弥散性分布；伤后6小时，胞浆中弥散性分布的阳性物染色强，部分神经元胞浆中的阳性物与血管内的阳性物相连接，少数阳性细胞的突起及胞核亦呈阳性反应；伤后15～24小时，阳性细胞数目增多，染色更强，且阳性细胞的分布较广泛。但在大脑组织中，各时间组均未见到Al阳性细胞，仅少数血管周围组织间隙有阳性物。
三、讨论
1.脑损伤后BBB的改变：脑组织受损后，血液中的辣根过氧化物酶及Evans蓝［3］等物质均可进入脑组织，说明BBB受到了破坏。研究表明，BBB异常可表现为两种形式［1］：（1) 结构破坏，多由外力作用于脑组织直接造成血管破裂，血液中的各种成分均可进入脑组织，不受分子大小的限制；（2) 功能障碍，多由缺血、早期梗死等病理改变间接导致血管通透性增加，对进入脑组织的血液成分具有选择性。本实验发现，在针刺造成脑干损伤局部，生前组致伤0.5小时即可见到Al进入到血管周围神经组织，并出现Al免疫阳性细胞，提示BBB在脑干损伤后发生了功能障碍或/和结构破坏。在死后损伤组，血管周围间隙有Al阳性物，这可能是针刺直接导致了血管破裂。
2.脑损伤后出现Al阳性神经细胞的意义：本研究发现，在脑干生前致伤组，脑干组织中有Al阳性神经细胞；而在死后损伤组的脑干组织中未见Al阳性神经细胞，说明Al阳性神经细胞的出现不是死后改变引起的，而是损伤所致。目前，有关脑损伤后出现血浆蛋白阳性神经细胞的机制尚不清楚。一般认为，在BBB损伤的基础上，血浆蛋白进入神经细胞可能有两条途径：(1) 以渗透方式顺浓度梯度进入，为被动转运过程；(2) 经胞膜上的蛋白通道进入，为主动摄取过程［4］。而对某一细胞，两种途径是单独或共同存在，尚需进一步研究。我们推测，对于损伤较重的细胞，胞膜功能在早期尚未完全丧失，可通过蛋白通道主动摄取血浆蛋白，而晚期由于细胞膜功能完全丧失，血浆蛋白可顺浓度梯度渗入胞浆，至胞内外浓度达到平衡；对于损伤轻微或未受损伤的细胞，胞膜功能可维持正常而通过蛋白通道摄取或不摄取血浆蛋白。本研究中还发现，在脑干生前致伤0.5小时，大多数细胞的Al阳性物仅分布于靠近胞膜的胞浆中而呈环状，随损伤时间延长，胞浆内的阳性物呈弥散性分布，且染色增强。有文献报道［5］，血浆蛋白在神经细胞胞浆内的多少及分布有两种情况：(1) 阳性物少而仅位于靠近胞膜的胞浆中，可能是由胞体的细胞膜、树突及轴突末端摄入所致，这类细胞所受损伤极轻或未受损伤；(2) 阳性物多，在胞浆中呈弥散分布，可能是被动转入所致，提示细胞膜功能丧失，神经细胞可能发生了不可逆损伤。本实验结果说明在脑干损伤早期，部分神经细胞发生了不可逆损伤，其功能必将发生改变，它们对脑干整体机能的影响值得进一步研究。
*本课题为国家自然科学基金资助项目（No. 39470766）
作者单位：邓 平 510182 广州医学院神经科学研究所；
徐小虎 汕头大学医学院法医研究所；
祝家镇、宋一璇 中山医科大学法医学系
参考文献
1 Liu HM, Sturner WQ. Extravasation of plasma proteins in brain trauma. Forensic Sci Int, 1988, 38: 285-295.
2 邓平, 徐小虎, 祝家镇. 从胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞数推断脑干损伤时间. 中山医科大学学报, 1997, 18: 260-263
3 Tengvar C. Extensive intraneuronal spread of horseradish peroxidase from a focus of vasogenic edema into remote areas of central nervous system. Acta Neuropathol, 1986, 71: 177-189.
4 Loberg EM, Torvik A. Uptake of plasma proteins into damaged neurons. Acta Neuropathol, 1991, 81: 479-485.
5 Hoshino S, Kobayashi S, Nakazawa S. Prolonged and extensive IgG immunoreactivity after severe fluid-percussion injury in rat brain. Brain Res, 1996, 711: 73-83.
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