神经生长因子对脊髓损伤后c-fos mRNA和c-fos蛋白表达的影响
曹晓建 罗永湘
为进一步研究神经生长因子（NGF）保护脊髓损伤组织的作用机制，进行了c-fos基因的原位杂交和免疫组化研究。
一、材料与方法
实验分组：Wistar大鼠45只，雌雄不分，体重200～250 g。随机分成3组：正常对照组（鼠数＝5），不损伤脊髓，作为c-fos基因的正常对照；等渗盐水组（鼠数＝20)，脊髓损伤后经蛛网膜下腔导管注入盐水；NGF组（鼠数＝20），同样经蛛网膜下腔导管注入NGF。
脊髓损伤模型的建立：以质量浓度为3 g/L的戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉，以T8棘突为中心，取背部后正中切口长约5 cm，切开皮肤、皮下组织，咬除T8棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径为3 mm的图形区，作为脊髓损伤区。再咬除T9～T10的棘突及左侧椎板，显露硬脊膜，作为蛛网膜下腔置管区。用Allen装置，选用10 g×2.5 cm致伤冲量损伤T8脊髓，成功后位于T10处硬脊膜偏离后正中血管左侧剪开一小洞，将细塑料管向脊髓损伤方向蛛网膜下腔插入3 mm，导管与椎旁组织及皮肤固定。
术后处理：NGF组分别于术后即刻、10，30分钟及1，2，3，4小时经导管各注入24μl NGF溶液（含NGF 60μg，由武汉生物制品研究所提供）。各组于术后15分钟及1，2，4小时每组分别取5只动物断头处死取材。切取损伤区脊髓组织，中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片。等渗盐水组在同时间内注入等量的等渗盐水作为对照，取材同NGF组。
原位杂交：用地高辛标记探针c-fos探针进行标记及杂交，结果用TJTY－300图像分析仪进行图像分析。免疫组化染色：按SABC法常规操作，结果判定同原位杂交。统计学处理：所有结果均以±s表示，组间差异比较采用t检验。
二、结果
1．c-fos mRNA原位杂交结果见表1。
2.c-fos蛋白表达结果见表1。
表1 c-fos mRNA和c-fos蛋白在脊髓损伤后的表达（±s）
组别 鼠数 术后时间 c-fos mRNA c-fos蛋白
正常对照组 5
即刻
1.04±0.48
4.87±0.61
等渗盐水组 5
15min
4.09±0.19
5.94±0.93
5 1h 10.66±1.88 8.29±1.20
5 2h 7.18±0.23 16.76±1.09
5 4h 5.34±0.42 16.76±1.09
NGF组 5 15min 3.21±0.59** 5.18±0.68
5 1h 8.56±0.34** 6.79±0.31**
5 2h 6.37±0.43** 12.96±0.91**
5 4h 4.38±0.99** 9.84±0.77**
与等渗盐水组比较： **P<0.01
讨 论
本实验结果显示，脊髓损伤后，脊髓神经c-fos mRNA和c-fos蛋白表达明显增高，c-fos可能参与了脊髓神经元损害及继发性损害。以往很多研究证明，c-fos的作用是经兴奋性氨基酸（EAA）诱导产生，并与钙密切相关。脊髓损伤后，EAA水平显著上升。笔者以往研究已证实NGF能抑制损伤后EAA的升高效应。本研究证实，NGF能显著抑制脊髓损伤后c-fos基因表达，从而保护损伤的神经组织。脊髓损伤后c-fos mRNA和c-fos蛋白表达高峰时间不一致，这是由于c-fos蛋白表达从转录到翻译的时间差所致。很多研究也发现了这一现象。一般认为，高峰可延迟1～4小时。
NGF的作用机制可能是由于NGF抑制损伤后EAA的活性升高，间接抑制c-fos基因表达，从而保护神经组织。
*本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39470701)
作者单位：曹晓建 210029 南京医科大学第一附属医院骨科；
罗永湘 同济医科大学附属同济医院
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