流式细胞技术DNA倍体分析诊断无精症
王友宝 章咏裳 李家贵 周四维 叶章群用流式细胞技术(FCM)DNA倍体分析的方法，对无精症患者睾丸细针抽吸细胞进行检查，并与传统的病理及细胞学检查进行比较。
1 材料与方法
1.1 组织标本的获得及病理学检查
选择12例自愿同时接受细针抽吸细胞学检查及开放手术活检的无精症患者，平均年龄27岁，不育时间1～6年。1%利多卡因精索封闭，阴囊局部皮下浸润麻醉，用带20 ml注射器的20 G穿刺针进行抽吸。先将穿刺针刺入白膜下，提拉注射器筒芯，在产生持续负压的情况下，向睾丸不同方向迅速穿刺3～4次。在维持负压的情况下退出穿刺针，仔细将一滴穿刺液垂直滴于玻片上，立即推片，95%乙醇固定，风干，瑞氏染色镜检。其余用2.5 ml含0.1%Ⅳ型胶原酶(Sigama)的RPMI 1640液冲洗入试管中，待做FCM检查。穿刺后立即在阴囊皮肤做小切口，切开睾丸白膜0.3～0.5 cm，轻挤睾丸，用锐利刀片切取挤出的睾丸组织一小块，约0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm。将一部分组织立即置入Bouin液固定，做病理切片检查，另一部分置入0.2～0.3 ml冷生理盐水(NS)中，做FCM检查。
对照组标本取自4例卒死壮年男性睾丸，立即做细针抽吸细胞学检查及开放手术活检，采取标本方法同上。
1.2 FCM检查
1.2.1 单细胞悬液的制备及DNA染色：将开放手术活检所取睾丸组织置于0.2～0.3 ml冷NS中剪碎。加入2.5 ml含0.1%Ⅳ型胶原酶的RPMI 1640液，置37℃温箱消化1 h，并间断吹打或震荡。细针抽吸细胞的消化时间可缩短至30 min。45 μm尼龙网过滤后，1 500 r/min 离心10 min，沉淀加0.5 ml NS混匀后用吸管吹入70%乙醇(4℃)中，4℃冰箱中固定1 h。1 500 r/min离心10 min，弃去乙醇，PBS漂洗两次。沉淀加1～2 ml EB染液(含EB 10 μg/ml，RNA酶A 10 μg/ml)混匀后，4℃冰箱染色30
min。离心，沉淀加1～2 ml PBS缓冲液，45 μm尼龙网过滤后，上机分析。
1.2.2 DNA倍体分析：用FACsort流式细胞仪，计数10 000个细胞，具有相同DNA含量的细胞群表现为直方图中独立的峰，即每个峰表示一定DNA含量或倍体的细胞亚群。在正常对照组中，第1个峰代表单倍体(1C)细胞亚群，第2个峰代表双倍体(2C)细胞亚群，第3个峰则代表四倍体(4C)细胞亚群。计算机系统算出每个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。
1.2.3 诊断标准：根据Lee及Kaufman等的标准，单倍体细胞百分数与正常对照组单倍体细胞平均百分数相比较，在其两个标准差之内为正常，否则为异常。或根据各倍体间的关系，当1C＞2C＞4C时为生精功能正常，2C＞1C＞4C为生精功能低下，2C＞4C＞1C为生精阻滞。仅有2C峰，即2C占100%，表示无生精细胞(如唯支持细胞综合征)。
2 结果
对照组4例睾丸病理切片均显示生精功能正常，抽吸细胞涂片可以见到各级生精细胞。手术取得的组织及抽吸所得的细胞在FCM检查时各倍体细胞间的关系均为1C＞2C＞4C。各倍体细胞所占比例为：1C，(41.6±6.4)%；2C，(20.7±7.1)%；4C，(11.4±5.3)%。两种取材方法FCM检查，各倍体间有很好的相关性：1C，r=8.6；2C，r=8.1；4C，r=8.4，P＜0.01。
12例无精症患者中，经细胞涂片染色，8例诊断为生精阻滞(见到生精细胞，但无精子及精子细胞)，2例唯支持细胞综合征(未见生精细胞)，2例生精功能正常(见到各级生精细胞)。其中前10例的诊断与组织切片病理学检查及FCM检查相符。后2例经FCM检查，其中1例为生精功能低下(2C＞1C＞4C)，另1例正常(1C＞2C＞4C)，亦与组织切片的检查结果相符。
3 讨论
FCM可以通过细胞DNA测定，区分不同DNA含量的细胞，而用于睾丸不同细胞成分的定量分析。正常睾丸生精上皮中，各级生精细胞DNA含量有明显变化，精子及精子细胞为1C，支持细胞、G0/G1期精原细胞、间质细胞及次级精母细胞为2C，初级精母细胞、G2和M期精原细胞为4C。在2C细胞中，次级精母细胞存在时相很短，即使切片上也不易见到，而间质细胞只占全部有核细胞的2%，所以这两种成分可被忽略。因此，1C可代表精子及精子细胞，2C代表精原细胞，4C代表(初级)精母细胞。3种成分在FCM直方图上表现为从大到小的3个峰(即1C＞2C＞4C)。睾丸生精功能受损，总是最成熟的精子或精子细胞先消失或减少，而后是精母细胞，直到最后仅剩下支持细胞。因此，生精功能低下者，因1C细胞减少，3种DNA含量的细胞比例关系为2C≥1C＞4C。生精阻滞几乎无单倍体细胞，表现为2C＞4C＞1C。唯支持细胞综合征只有2C峰，即2C占100%。另外，正常成人睾丸1C细胞约占(40.1±8.4)%，本组为(41.6±6.4)%。从1C细胞的比值也可了解生精状态。
处于分裂时相的细胞为S期细胞，在FCM的直方图上位于峰与峰之间的区域。Lee认为S期细胞对于FCM DNA分析无特别意义，但生精功能低下者可出现高S期细胞。
本实验12例无精症患者，FCM诊断与开放手术活检相同，手术和细针抽吸两种活检方法所取标本的FCM检查，各倍体间有很好相关性，且诊断结果一致。1例细胞涂片诊断为生精功能正常者，FCM诊断为生精功能低下，与组织切片结果相符。因此，FCM DNA倍体分析可以客观、准确、简便、定量地对无精症患者的生精功能做出诊断；细针抽吸所获得的细胞标本完全可满足FCM的要求，从而使FCM准确判断睾丸生精功能更为简便。但是，FCM DNA分析因不能反映睾丸间质及精曲小管结构的异常，所以其诊断也有一定局限性。
作者单位：王友宝，青岛市第二人民医院泌尿外科(山东青岛，266033)；
章咏裳 李家贵 周四维 叶章群，同济医科大学附属同济医院泌尿外科
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