不明原因男性不育患者精子核DNA与形态定量研究
张永良 夏斌 胡海霞摘要 目的：探讨不明原因男性不育患者精子核DNA定量及精子形态的变化情况。方法：对50例正常生育男性和35例不明原因不育患者精液进行精子核DNA积分吸光度、平均灰度和精子面积、核长、核宽、周长、圆度、尾长等定量分析。结果：不育患者精子核DNA积分吸光度明显减低(P＜0.01)，平均灰度明显增高(P＜0.01)，面积、核长、核宽、周长、圆度、尾长与生育男性比较，无显著性差异(P＞0.05)。结论：不明原因男性不育患者精子核DNA积分吸光度明显减低，可能与其精子发生和成熟过程中染色质缩合障碍有关。
关键词 男性不育 精子 DNA分析
Study of sperm core DNA quantity and form in male sterility
Zhang Yongliang* Xia Bin Hu Haixia
(*Department of Laboratory,251 Hospital of PLA,Hebei,075000)
Abstract Purpose:In order to study the unknoun reason male sterility patient′s sperm core DNA quantity and the circumstanlce change about the sperm form.Methods:The semen of 50 normal fertility′s male was compared with 35 unknown reason of sterility patient′s,analysing sperm core DNA integral optical density,average grey matter,the quantity and form about sperm′s area,core′s length,core′s width perimeter circumference tail′s length,etc.Results:Sterility patient′s sperm core DNA integral optical density had a clear reduction (P＜0.01);average grey matter had a clear increase (P＜0.01),area core′s length core′s width perimeter circumference and tail′s length contrast with fertilitys male′s had no significant difference (P＞0.05).Conclusions:The unknoun reason male sterility patient′s sperm core DNA integral optical density had a clear reduction.
Key words Male infertility Spermatozoa DNA analysis
本研究通过对不明原因男性不育患者精子核DNA及形态图像定量分析，探讨其发病原因。
1 材料与方法
1.1 对象
生育组50例，年龄24～47岁，平均28.5岁。无全身性及生殖系统疾病，其配偶均在怀孕中。不育组35例(排除女方原因)，年龄28～40岁，平均29.4岁。所有受试者，用手淫法采取精液。精液常规检查均在WHO正常值范围内。
1.2 染色
取液化精液涂片，吹干后95%乙醇固定10 min；浸入1 mol/L HCl溶液中微波内置5档，4 min；浸入Schiff液中，微波内置5档，5 min；10 g/L淡绿复染10 s；水洗，晾干待测。
1.3 检测
采用CMIAS-B真彩色医学图像分析仪(空军总医院生物医学工程研究所研制)。①将染色后的涂片置显微镜下，对所测目标定位后，通过摄像机将被测物的各种信息转换成数字图像，传送到主计算机系统；②标定涂片空白处入射光的吸光度值，在监视器上采用不同的分割方法和编辑功能，对图像做分割处理；③对分割出来的目标进行测量、计算、统计。测定指标包括精子核DNA积分吸光度、平均灰度和精子面积、核长、核宽、周长、圆度、尾长。所测精液涂片每例检测100个精子。
2 结果
精子核DNA与精子形态图像定量检测结果见表1。
表1 不明原因不育男性精子核DNA与精子形态图像定量检测结果 ()
组别 DNA积
分吸光度 平均灰度 面积
(μm2) 核长
(μm) 核宽
(μm) 周长
(μm) 圆度 尾长
(μm)
不育组 1.62±
0.75 79.98±
8.79 11.92±
2.17 4.25±
0.11 2.68±
0.61 12.28±
1.18 1.29±
0.15 55.62±
3.14
生育组 2.10±
0.68 74.29±
7.63 11.01±
2.01 4.09±
0.85 2.50±
0.53 11.82±
1.09 1.24±
0.11 56.81±
2.84
P值 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05
从表1可见，不育男性与生育男性比较，精子核DNA积分吸光度明显减低(P＜0.01)，平均灰度明显增高(P＜0.01)，面积、核长、核宽、周长、圆度和尾长等无显著性差异(P＞0.05)。
3 讨论
人类睾丸的精子发生过程中，精子细胞内与核DNA相结合的碱性蛋白组型发生了转换，即先由中间型碱性蛋白取代组蛋白，最终由富含精氨酸和半胱氨酸的鱼精蛋白取代中间型碱性蛋白〔1，2〕。鱼精蛋白又称精核蛋白，呈高度碱性，通过氢键和离子键结合于DNA双螺旋的小沟内，较组蛋白更易与DNA结合，能中和DNA链中的负电荷，消除DNA键间的静电排斥作用，使染色质高度浓集，并能通过分子内和分子间形成二硫键，使核染色质结构高度稳定。精子基因在此种精子特有的碱性蛋白保护下，紧密浓集，不发生转录。染色质浓缩使精子细胞核体积大大缩小，精子最终呈流线形便于运动〔3〕。Balhorn和Belokopytova等〔4，5〕先后报告，不育男性精子生成过程中染色质的鱼精蛋白含量较正常者少，由组蛋白向鱼精蛋白转化过程受阻。如果鱼精蛋白取代组蛋白不充分，组蛋白过多地留在精子核内，造成染色质不均一，势必影响染色质浓缩和精子成形。精子的核碱性蛋白组型异常，可降低精子的受精能力，或使精子丧失受精能力而致不育。
DNA积分吸光度变化可反映出精子染色质缩合程度，精液中若出现低缩合精子，提示精子发生或成熟有障碍。本组采用DNA染色原理进行染色，利用盐酸水解DNA，在脱氧戊糖和嘌呤之间断开，在戊糖的一端形成醛基，当加入Schiff试剂时，醛基与之结合，形成紫红色化合物而将核内的DNA显示出来〔6〕。精子发生和成熟过程中，染色质经历一个逐渐缩合阶段，Schiff试剂对DNA有一定的亲合力，它与图像定量分析仪结合可检测出精子染色质缩合程度和精子成分内在差别，这种差别可反映出精子发生过程中的障碍。图像定量分析具有快速、高效、精密度高、重复性好等优点，对比度强，分辨率高，结果由计算机处理，可以客观精确地用数字表达被测物的各种信息〔7〕。不仅可测量精子核DNA反应的强弱，而且可测量其形态参数各指标，通过检测可客观地反映精子的不同侧面，这是传统的检查法所不及的。
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