HyTK基因逆转录病毒重组质粒的构建及其在PA317细胞中的高表达
叶传忠 陈仕平 裴雪涛 李梁 冯凯摘要 目的：为开展逆转录病毒介导的HyTK基因治疗恶性肿瘤奠定实验基础。方法：利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒pL(HyTK)SN，应用新一代的非脂质体基因转导系统FuGENETM6将构建的pL(HyTK)SN导入Ψ2单嗜性包装细胞并获得瞬间表达，继而再转染PA317双嗜性细胞。结果：获得高滴度重组病毒，上清逆转录病毒滴度为5.4×106 cfu/ml。结论：所构建的HyTK基因可用于治疗恶性肿瘤。
关键词 基因疗法 肿瘤 基因重排 基因转移 基因表达
Construction of recombinant retrovirus vector of hygromycin phosphotransferase
-thymidine kinase fusion gene and its expression in PA317 cells
Ye Chuanzhong? Cheng Shiping? Pei Xuetao et al
(?Department of Urology,Union Hospital,Fujian Medical
University,Fuzhou,350001)
Abstract Purpose:To lay an experimental foundation of retrovius-mediate hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene(HyTK) therapy for malignant tumors.Methods:A retroviral expression vector pL(HyTK)SN was constructed with hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene(HyTK) and a retroviral vector pLXSN. By using FuGENE TM 6-mediated transfection and "ping-pong effect" technique,pL(HyTK)SN was transfected into amphotropic packaging cell line.Results:The results of RT-PCR assay showed that the HyTK gene was successfully transferred into PA317 cell line.High-titer of retroviral supernatant 5.4(10 6 cfu/ml) was obtained.Conclusions:These results lay foundations for gene therapy of neoplasm by using retrovius-mediate HyTK gene transfer.
Key words Gene therapy Tumor Gene recombinant Gene transfer Gene expression
自杀基因(suicide gene)是目前众多肿瘤基因治疗方案中较有发展前景的一种，其中最具代表性的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因/丙氧鸟苷(gancyclovir，GCV)系统，即通过单纯疱疹病毒胸苷激酶将抗病毒核酸类似物GCV磷酸化，导致DNA合成抑制、细胞死亡。而哺乳动物细胞HSV-TK基因(以下简称TK基因)则无此功能。因此，向哺乳动物细胞中导入TK基因后，给予GCV等药物，可造成那些表达TK基因的细胞死亡，从而达到治疗的目的。
我们利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和TK的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒，经FuGENETM 6基因转导系统将此质粒作为目的基因，转入包装细胞(Ψ2单嗜性细胞及PA317双嗜性细胞)，通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒，达到治疗恶性肿瘤的目的，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
DMEM、Trizol RNA提取试剂盒由GIBCO提供；潮霉素、FuGENETM 6转染试剂盒由Boehringer-mannheim提供；DNA纯化试剂盒、PCR产物回收试剂盒由Clontech提供；polybrene由Sigma公司提供；T4连接酶、限制性内切酶Xho Ⅰ 、BamH Ⅰ 、Nhe Ⅰ 、Hind Ⅲ 、反转录试剂盒、Taq酶由Promega提供。PCR引物第1对为：P1：5′-gAAACCgA-
ACTgCCCgCTgT-3′，P2：5′-gCCgTCAACCAAgCTCTgAT-3′，扩增530 bp的HyTK基因片段；第2对用于扩增249 bp的内参照β-actin基因〔1〕，P3：5′-AAggCCAACCgCgAg-
AAgAT-3′，P4：5′-TCggTgAggATCTTCAT-
gAg-3′，均由上海Sangon公司合成。胎牛血清(FCS)由杭州四季清提供。
1.2 质粒、细胞株及菌株
质粒tgCMV/HyTK由第三军医大学王征旭博士惠赠，内含2.0 kb潮霉素磷酸转移酶和TK融合基因的互补脱氧核糖核酸(cDNA)〔2〕，逆转录病毒载体pLXSN、真核表达载体pCIneo、大肠杆菌X-blue菌株、Ψ2单嗜性细胞及小鼠成纤维细胞NIH3T3由本室保存，PA317双嗜性细胞由第一军医大学曾嵘博士惠赠。以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中含10%胎牛血清、200 mmol/L的L-谷氨酰胺，在5%CO2、37℃中培养。
1.3 质粒的构建及鉴定
将tgCMV/HyTK的HyTK基因克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，构建成pL(HyTK)SN(图1)。根据文献〔3〕方法制备XL1-blue菌感受态，电穿孔法转化，小提取质粒DNA，紫外分光光度计定量，酶切鉴定。
图1 pL(HyTK)SN逆转录病毒载体构建流程图
1.4 重组病毒的包装及病毒上清滴度测定
病毒的包装按文献〔4〕方法稍加改进。接种5×105Ψ2细胞于6孔培养板，至细胞汇合达50%左右，按FuGENETM6流程说明，质粒定量为2 μg，与FuGENETM6基因转染试剂8 μl混合后转染Ψ2细胞过夜，表达72 h后收集上清。接种1×105 PA317细胞于6孔培养板中至汇合程度达40%左右，加入Ψ2细胞上清及使终浓度为8 μg/ml的polybrene，12 h后更换培养液，2 d后潮霉素(400 μg/ml)加压筛选，挑取抗潮霉素的阳性克隆继续培养传代，得到产逆转录病毒的包装细胞系PA317/HyTK。按文献〔4〕方法收集病毒上清。病毒上清滴度测定按文献〔4〕方法进行。
1.5 分泌双嗜性重组病毒包装细胞系的鉴定
使用RT-PCR方法检测转基因细胞的HyTK表达情况，参照Trizol RNA提取说明书提取PA317/HyTK细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明合成cDNA，取2.5 μl cDNA用于PCR扩增，50 μl体系：200 μm dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+、4种引物各0.5 μmol/L，95℃预变性1 min，加Taq酶2 u。反应条件：94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，30个循环后72℃延伸7 min，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GDS800型凝胶图像分析系统(UVP公司)成像。
2 结果
2.1 质粒的构建及鉴定
如图1所示，先用NheⅠ及SalⅠ双酶切质粒tgCMV/HyTK，回收2.1 kb片段，获得HyTK基因；XbaⅠ及SalⅠ双酶切载体pCI-neo并回收大片段、T4连接酶连接并转化宿主菌X-blue，快速小量制备质粒DNA，获得质粒pCI-neo/HyTK，再将此质粒用 XhoⅠ及SalⅠ双切回收获2.1 kb片段；将PLXSN用XhoⅠ切开后CIP去磷酸化，两者T4连接酶连接并转化、提取质粒DNA，XbaⅠ单酶切鉴定，XhoⅠ+BamHⅠ双酶切鉴定(图2)。
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