干扰素α对膀胱癌细胞多药耐药性逆转作用的研究
金欢胜 杨唐俊 何斌 王祥卫摘要 目的：探讨干扰素α(IFN-α)对膀胱癌细胞多药耐药性的逆转作用。方法：以人膀胱移行上皮癌细胞系BIU87和BIU87/ADM为研究对象，应用MTT法检测阿霉素(ADM)的细胞杀伤作用、荧光法检测细胞内ADM浓度和斑点杂交法检测mdrl mRNA相对含量。结果：500 IU/ml IFN-α能明显增强ADM对耐药细胞BIU87/ADM的杀伤作用，但不能增强ADM对敏感细胞BIU87的杀伤作用；IFN-α能增加ADM在BIU87/ADM细胞内的积聚，但并不改变mdrl mRNA在细胞内的表达量。结论：IFN-α对膀胱癌细胞多药耐药性具有逆转作用，其机制与IFN-α增加细胞内抗癌药物浓度有关，与mdrl mRNA表达量无关。
关键词 膀胱肿瘤 药物耐受性 阿霉素 干扰素α
Reversal of multidrug resistance by IFN-α in bladder cancer cell lines
Jin Huansheng Yang Tangjun He Bin et al
(Department of Urology,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical
University,Chongqing,400037)
Abstract Purpose:To evaluate the reversal of multidrug resistance by-interferon (IFN-α) in bladder cancer cell lines.Methods:The effect of recombinant human IFN-α on the cytotoxicity of adriamycin(ADM) in human bladder cancer cell line BIU87 and its multidrug resistant counterpart BIU 87/ADM were studied by MTT assay,ADM accumulation in above cell lines were also detected by spectrofluometric analysis.Results:The results showed that IFN-α (500 IU/ml) increased the cytotoxicity of ADM and enhance the accumulation of ADM in BIU87/ADM cells,but (IFN-α) (500 IU/ml) had no effects on the cytotoxicity of ADM to BIU87 cells,the level of mdr1 mRNA was unchanged as assessed by dot blot analysis.Conclusions:IFN-α has the reversal effect on multidrug resistance in bladder cancer cell lines.
Key words Bladder cancer Multidrug resistance Adriamycin Interferon-α
多药耐药性(multidrug resistance,MD-
R)是影响肿瘤化疗效果的最大障碍之一。虽然一些药物(如异搏定等)具有逆转肿瘤细胞MDR的作用，但因其毒副作用严重影响了临床使用。干扰素(interferon,IFN)用于肿瘤治疗已多年，有关IFN联合化疗药物治疗膀胱癌及IFN逆转膀胱癌MDR的研究尚未见报道。笔者应用非抑制剂量IFN-α加小剂量阿霉素(adriamycin,ADM)分别对人膀胱移行上皮癌BIU87、BIU87/ADM细胞的杀伤作用进行研究，以探讨IFN-α对膀胱癌细胞MDR的逆转作用。
1 材料与方法
1.1 实验细胞系及药物
人膀胱移行上皮癌细胞系BIU87引自北京医科大学泌尿外科研究所，BIU87/ADM细胞系由本科建立〔1〕。培养基为含15%小牛血清的RPMI 1640。
ADM为意大利产品，IFN-α为国产。按所需浓度稀释，-20℃冻存。
1.2 细胞生存率及细胞内ADM积聚量测定
应用MTT法检测各样品吸光度，并计算各种药物浓度下的细胞生长抑制率。应用荧光法检测各样品ADM荧光强度，根据标准曲线计算单位细胞内ADM积聚量(用μg/105细胞表示)。
1.3 mdrl cDNA探针的制备及斑点杂交
按蔡文琴等〔2〕介绍方法进行。膜显色后，置膜于GSG 10型双波长薄层扫描仪540 nm波长处扫描；用C-RIB型数据记录仪记录扫描图谱，并计算各点对应波峰的面积；用标准mdrl cDNA浓度的对应数值作标准曲线，并由此曲线计算出各测定点所含相对同源DNA的mRNA量。
2 结果
2.1 不同浓度的IFN-α对细胞生长的影响
IFN-α浓度为500 IU/ml时对BIU87和BIU87/ADM细胞无明显抑制作用；当IFN-α达2 000 IU/ml时，BIU87和BIU87/ADM细胞均出现较显著的抑制作用；各种浓度的IFN-α对BIU87和BIU87/ADM细胞的作用无显著性差异(P＞0.05)。
2.2 非抑制剂量IFN-α和ADM的复合抗癌作用
结果见表1。
表1 BIU87、BIU87/ADM在不同处理因素下的
细胞生存率
%
处理因素 BIU87 BIU87/ADM
IFN-α 24 h 99.4±4.6 100.1±3.2
ADM 1 h 60.5±3.9 97.1±1.8
IFN-α 24h+ADM 1h 60.1±5.5 88.8±4.7
BIU87/ADM细胞经500 IU/ml IFN-α作用24 h后，再用2 μg/ml ADM作用1 h，3 d后用MTT法检测细胞生存率，结果发现，IFN-α能显著增强ADM对BIU87/ADM细胞的杀伤作用。但应用相同方法检测IFN-α加ADM对BIU87细胞的杀伤作用发现，IFN-α不能增强ADM对BIU87细胞的杀伤作用。
2.3 IFN-α对细胞内ADM积聚量的影响
结果如图1所示。标准的ADM浓度(X)与相应的荧光值(Y)呈正相关，直线回归方程为Y=36.440 1X，r=0.999 6，P＜0.01。在4个不同浓度的ADM作用下，BIU87/ADM细胞内ADM积聚量均显著低于BIU87细胞(P＜0.05)；而先应用500 IU/ml IFN-α作用BIU87/ADM细胞24 h后，则能使BIU87/ADM细胞内ADM积聚量增加，与单用ADM相比较有显著性差异(P＜0.05)。
图1 干扰素α对BIU87/ADM细胞内ADM积聚量的影响
2.4 IFN-α对mdrl mRNA表达的影响
mdrl cDNA探针分别与BIU87/ADM细胞及经IFN-α作用24 h后的BIU87/ADM细胞进行斑点杂交。经薄层扫描仪对mRNA的定量分析表明，两者mRNA含量分别为(513.62±9.58)pg/μg总RNA和(543.50±49.72) pg/μg总RNA，两者比较无显著性差异(P＞0.05)。
3 讨论
现已明确，MDR的发生主要和mdrl基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)有关，即在三磷酸腺苷的作用下，P-gp能主动地将细胞内的化疗药物泵出细胞外，从而降低肿瘤细胞内化疗药物的浓度，导致化疗失败。目前证实，奎尼丁、异搏定、环孢素A和奎宁等药物对MDR具有逆转作用，但上述药物因其毒性难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，因此难以应用于临床。近年来，有报告应用IFN膀胱灌注治疗膀胱癌，认为IFN毒性较低，即使剂量达1×109 IU也未见剂量毒性〔3〕。
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