KCOS对弥漫性轴索损伤后鼠脑组织中C-FOS和HSP70表达的影响
吴安华 张沈丽 李金铭 杨国瑞 王树成
笔者应用原位杂交技术，检测了ATP敏感K(KATP)通道开放剂（KCOS）对弥漫性轴索损伤（DAI）导致的鼠脑中C-FOS和热休克蛋白(HSP)70表达的影响。
一、材料与方法
1. 弥漫性轴索损伤动物模型的制备及病理观察：动物模型采用 Anthony等［1］所述方法，取SD 大鼠 60只，体重为350～375 g，打击重量为450 mg，打击高度为 2 m。于打击前 20 min向实验组（30只）脑室内注入KCOS Pinacidil(10 nmol/5 μl),对照组（30只）则向脑室内注入相同体积的等渗盐水。于打击后10 min， 2， 6, 24 h分别处死部分大鼠，取脑之前以等渗冰盐水（20～50 ml）行右心腔灌注,迅速断头取脑，使用 OCT包埋剂包埋后放入液氮中保存。
2. 探针的制备：合成于上海塞尔生物工程公司。
3. 原位杂交：将液氮中保存的标本放入-70℃低温冰箱中过夜后切片，厚度为10 μm。切片部位分别为打击部位下皮层、海马、丘脑、脑干。将切片与探针进行原位杂交，应用 NBT/BCIP试剂盒显色，显微镜下观察。
二、结果
打击后,实验组动物死亡11只，对照组动物死亡13只，所有死亡动物仅行病理检查，未进行原位杂交检验。原位杂交结果显示：打击后10 min时，对照组皮层中即出现C-FOS的表达， 2 h时表达强度增加， 6 h时达高峰， 24 h时开始下降。海马、丘脑及脑干部位的C-FOS表达方式与皮层相似。实验组于外伤后 6 h于皮层区可见少量的C-FOS表达，而海马和脑干部位则未见C-FOS的表达。打击后 6 h，对照组皮层与海马中开始出现HSP70的表达，24 h时表达强度增加，丘脑及脑干等部位未见HSP70的表达。实验组脑组织中未见HSP70的表达。对照组和实验组大体病理未见显著差别。死亡的动物可见较大量的硬膜外血肿。
三、讨论
实验证实，脑中的KATP通道与心脏中的一样，可被同样的KCOS所激活［2］。目前认为，这些药物的作用靶点为 Sulfonylurea敏感的KATP通道，KCOS Cromakalin和Nicorandil对于黑质的亲和力大于平滑肌50～100倍［2］。本实验显示，应用KCOS后， DAI动物脑组织中C-FOS和HSP70的表达明显减少。这说明 KCOS可以减轻重症颅脑损伤所导致的 C-FOS 和HSP70等基因表达的增加，从而可以减轻脑损伤的严重程度，这可能是由于KCOS抑制了兴奋性神经递质如GABA等从SN末端的释放。同时，KCOS可使已去极化的神经末端超极化，从而使钙通道不能激活，抑制了钙内流和GABA等兴奋性神经递质的释放，进而减轻了由于外伤后细胞内钙超载和兴奋性神经递质释放所引起的神经细胞进一步损伤。本实验中，应用KCOS并未减轻实验组动物的大体病理改变及降低其死亡率，但由于它可以阻止应激性蛋白HSP70和C-FOS的表达，实验组动物神经细胞的继发性坏死将明显减少，随着时间的发展，其神经功能的恢复将明显优于对照组。
已有实验证实，多种类型的中枢神经系统损伤均可导致基因表达的显著改变，这包括应激性蛋白、结构蛋白、神经递质及神经因子等的变化，例如脑缺血后可诱导早反应基因(C-FOS)与热休克蛋白HSP70的表达。实验显示，缺血的破坏作用与编码C-FOS和HSP70等应激性蛋白的mRNA的表达相关。本实验显示，在弥漫性脑损伤时应用KCOS可阻止 C-FOS、HSP70的表达，表明此药可减轻由DAI所造成的应激性反应。说明了KCOS对抗重症颅脑损伤的优越性。同时，Heurteaux等［3］证实，KCOS可防止缺血诱导的神经元坏死及缺血诱导的多种基因如早反应基因（C-FOS，C-JUN）、 HSP70等的表达。由此笔者认为，KCOS对于DAI和脑缺血具有相同的作用机制。
本文编辑：蒋伟
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770758)
作者单位：吴安华（中国医科大学附属第一医院神经外科 110001 沈阳）
杨国瑞（中国医科大学附属第一医院神经外科 110001 沈阳）
张沈丽（中国医科大学药理学教研室）
李金铭（中国医科大学药理学教研室）
王树成（中国医科大学药理学教研室）
参考文献：
［1］Anthony M,Montasser A, Ard-Elfattall F， et al. A new model of diffuse injury in rats. Part 1: Pathophysiology and biomechanics. J Neurosurg， 1994,80:291-300.
［2］Heidy SA, Salvatore A, Michel F, et al. K+ channel openers activate brain sulfonylurea-sensitive K+ channels and block neurosecretion. Proc Natl Acad Sci USA， 1990,87:3489-3492.
［3］Heurteaux C, Bertaina V, Widmann C, et al. K channel openers prevent global ischemia-induced expression of C-FOS, C-JUN, heat shock protein, and amyloid B-protein precursor genes and neuronal death in rat hippocampus.Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:9431-9435.
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