大鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养与鉴定
伍亚民 马海涵 廖维宏
摘要： 目的 纯化培养并鉴定大鼠脑组织星形胶质细胞和少突胶质细胞。方法 根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，改进McCarthy方法纯化培养星形胶质细胞和少突胶质细胞，用免疫组化法对其鉴定。结果 (1)混合培养的星形胶质细胞和少突胶质细胞生长分化状况均优于纯化后的生长，以少突胶质细胞表现更为明显；(2)星形胶质细胞呈向心性生长，细胞相邻的接触面有较多的伪足；(3)传代培养的星形胶质细胞保持较强的分裂增殖能力，可在1周左右生长至完全融合，其纯度可达95%以上。纯化后的少突胶质细胞生长缓慢，抗物理、化学损伤的能力差，收获细胞丰度低，传代效果差。结论 (1)星形胶质细胞和少突胶质细胞存在相互促进生长的作用；而少突胶质细胞对损伤因素更敏感。(2)星形胶质细胞纯化培养较易；少突胶质细胞纯化培养较难。(3)改良McCarthy方法简单可靠。
关键词：星形胶质细胞；少突胶质细胞；培养；纯化；鉴定
中图分类号：R338-34 文献标识码：A
文章编号：1009-4237(2000)04-0207-04
The purified cultivation and identification of astrocytes and oligodendrocytes from rats
WU Ya-min,MA Hai-han,LIAO Wei-hong
(Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract: Objective To culture, purify and identify the astrocytes and oligodendrocytes from rat cerebral tissue. Methods Based on the different properties of cellular adhesions，developmental time-courses and growth pattern of astroglial cells and oligodendrocytes，astrocytes and oligodendrocytes were cultured and purified according to the improved McCarthy's method, and identified by immmunostaining.Results (1)Astrocytes and oligodendrocytes in mixed culture appeared better growth and differentiation than the respectively purified neuroglial, especially for the oligodendrocytes. (2) There were many pseudopod process among the astrocytes, which appeared centripetal growth mode.(3) The passaged astrocytes kept good abilities of division and proliferation and completely fused after 1 week of growth, and the purity was over 95%. The purified oligodendrocytes have a poor ability of growth and anti-physical and chemical damages, low ratios of abundance and generation.Conclusions (1) There are interactions of promoting growth between astrocytes and oligodendrocytes in mixed culture. The oligodendrocytes is more sensitive to damage factors.(2) The purification and cultivation of astrocytes are easier than that of oligodendrocytes.(3) The improved McCarthy's method is simple and reliable.
Key words:astrocyte；oligodendrocyte；cultivation；purification；identification
近年研究表明［1-4］，作为中枢神经系统胶质的主要组成部分的星形胶质细胞和少突胶质细胞对于损伤的敏感性存在极大的差异。星形胶质细胞多表现出反应性增生及活性因子的释放，而少突胶质细胞却发生明显的结构和功能损害。它们在损伤中枢神经再生修复中的作用也有差别，通过胶质网络及与神经元间的相互作用而参与中枢神经的再生修复［5-7］。为了深入探讨胶质细胞对损伤和再生修复的反应规律，研究其生物学行为和进行生化分析，体外进行星形胶质细胞和少突胶质细胞的实验研究是十分必要的。既往研究多用全脑匀浆和脑脊髓切片为对象，其结果能反映全部组织的共同特点而不能反映单一细胞的具体特性。而分离纯化同种细胞群体有助于深入了解其生物学特性和功能。本研究根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异与其生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，改进McCarthy方法进行星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养，用免疫组化法对其鉴定，取得满意效果，结果报告如下。
材料与方法
1 实验动物：Wistar大鼠由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。
2 主要仪器：台式高速离心机(TGL-16G，上海)、超净工作台(BCM-1000，苏州)、倒置显微镜(Laica，德国)、光学显微镜(BH-Z，Olympus，日本)、CO2培养箱(TC2324， Shel Lab)、解剖显微镜 (重庆光学仪器厂)、37℃恒温摇床 (江苏仪器厂)、水平摇床(江苏仪器厂)。
3 主要试剂及其配制：DMEM-F12(Gibco)、新生牛血清(Gibco)、Triton X-100(Sigma)、胰蛋白酶(Gibco)、胎盘蓝(Sigma)、多聚赖氨酸 (Sigma)、4%多聚甲醛(Gibco)、SABC-DS双染试剂盒(武汉博士德公司)、兔抗大鼠多克隆胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体(Sigma)、兔抗大鼠半乳糖脑苷脂（GC）抗体 (Sigma)，D-Hank's液［配方(g/l)：NaCl 0.8，KCl 0.4，Na2HPO4 0.068，KH2PO4 0.06，NaHCO3 0.35，酚红0.02］。
4 星形胶质细胞和少突胶质细胞的培养方法：参照McCarthy［8］方法，结合预实验情况建立星形胶质细胞和少突胶质细胞的分离培养及纯化方法，具体步骤如下。
4.1 大鼠皮层星形胶质细胞和少突胶质细胞的培养、纯化：(1)取新生1～2天的Wistar大鼠，无菌条件下取出大脑，置入D-Hank's液中，在解剖显微镜下剔除脑膜及血管组织，分离出大脑皮层备用；(2)剪碎后在0.125%的胰蛋白酶中37℃消化15分钟，用含有血清的培养基终止消化。轻轻吹打使细胞分散后，1000 r/min离心10分钟, 弃上清；(3)加入培养基，使细胞充分分离，行贴壁处理以除去纤维细胞。然后以1×106的密度接种于75cm2预先涂有多聚赖氨酸的塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养基为DMEM-F12(1：1)，含10%FCS；(4)生长8～10天待细胞融合后，置于37℃摇床中，250 r/min，14～16小时；(5)收集上清液，1000 r/min离心沉淀其中的少突胶质细胞，在DMEM-F12(1:1)10%FCS中以1×106的浓度接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，即可得到纯化的少突胶质细胞；(6)收集经摇床震荡后的贴壁细胞，加新鲜培养液培养，即可得纯度较高的星形胶质细胞。
4.2 SABC法双标鉴定混合培养的星形胶质细胞和少突胶质细胞：将附有神经胶质细胞的盖玻片从培养皿中取出，风干；4℃冷丙酮固定10分钟；新鲜配置3% H2O2，室温5～10分钟处理以灭活内源性过氧化酶；蒸馏水冲洗，2分钟×3次；滴加正常封闭血清，室温20分钟；甩去多余液体，滴加抗-GFAP，37℃1小时；0.01mol/L PBS(pH7.2-7.6)冲洗2分钟×3次；滴加生物素化二抗，20～37℃ 20分钟；0.01mol/L PBS(pH7.2-7.6)冲洗2分钟×3次；滴加SABC-AP，20～37℃ 20分钟；0.01mol/L PBS 5分钟×4次；BCIP/NBT显色：取适量蒸馏水，按1：20加试剂盒中4A和4B，混合后加至切片，室温10～60分钟,镜下观察以掌握终止显色时间；0.01mol/L PBS冲洗2分钟×3次；滴加双标阻断液，室温30分钟；0.01mol/L PBS冲洗2分钟×3次；滴加正常封闭血清，室温20°C；甩去多余液体，滴加适当稀释的（1：50）抗-GC，20～37℃ 1～2小时，0.01mol/L PBS洗2分钟×3次；滴加生物素化二抗，20～37℃20分钟；0.01mpl/L PBS洗2分钟×3次；滴加SABC-POD，20～37℃ 20分钟；0.01mol/L PBS洗2分钟×3次；AEC显色：取适量蒸馏水，以1：20稀释6A+6B，混匀后离心，加至切片。室温显色10～30分钟；蒸馏水洗涤；干燥后封片。
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