基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂在大肠癌中的表达
万远廉 魏群 潘义生 刘玉村
【摘要】 目的 研究基质金属蛋白酶（MMPs）及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）在大肠癌中的表达特点，与肿瘤发生发展的关系，以及在肿瘤治疗中的应用前景。 方法 采用RT-PCR方法测定28例大肠癌患者肿瘤组织和周围正常粘膜的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、膜型1-基质金属蛋白酶（MT1-MMP）、基质溶素（MMP-7）、组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）、组织金属蛋白酶抑制剂-3（TIMP-3）的mRNA表达状况，并将其结果与临床及病理学资料进行统计学分析。 结果 （1）27例患者肿瘤组织中MMP-7 mRNA表达阳性，MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2和TIMP-3在肿瘤组织和正常粘膜中均有高表达；（2）肿瘤组织中MMP-7 mRNA的表达水平与大肠癌患者的Dukes′分期相关(P<0.01)；（3）淋巴结阳性患者的肿瘤组织TIMP-2表达水平为(1.25±0.46)明显高于淋巴结阴性患者的(0.75±0.41)，差异有显著性意义(P<0.01)；（4）大肠癌患者癌周正常粘膜TIMP-3 mRNA表达随患者Duke′s分期的进展和肿瘤浸润深度的增加而降低(P<0.01)；（5）TIMPs与MMPs之间无明显相关关系(P>0.1)。 结论 MMP-7可望成为诊断大肠癌的敏感指标；人工诱导TIMP-2、TIMP-3或阻断MMP-7、MMP-2、MT1-MMP的表达可能抑制肿瘤的浸润和转移，成为肿瘤治疗的新途径。
【关键词】 结肠直肠肿瘤； 金属蛋白酶类； 金属蛋白酶类组织抑制剂
Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in colorectal neoplasm
WAN Yuanlian WEI Qun PAN Yisheng et al
（Department of General Surgery, First Hospital, Beijing Medical University，Beijing 100034, China）
【Abstract】 Objectives To explore the relationship of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) to the oncogenesis and development of colorectal neoplasm. Methods RT-PCR was used to assay the level of MMP-2, MT1-MMP, MMP-7, TIMP-2, TIMP-3 mRNA in 28 cases of colorectal cancer, including tumor tissue and surrounding normal tissue. Results MMP-2,MT1-MMP,TIMP-2 and TIMP-3 were over-expressed in tumor and normal tissues,and MMP-7 was strong-expressed in tumor tissue but was weak-expressed only in one case of normal tissue. The expression of MMP-7 in tumor tissue was correlated to Dukes stage(P<0.01). The expression of TIMP-2 in tumor tissue with positive-node was much higher than that with negative-node(P<0.01). The expression of TIMP-3 was decreased with the Dukes stage and the depth of invasion (P<0.01). There were no correlations between MMPs and TIMPs(P>0.1). Conclusions The expression of MMP-7 mRNA has a high specificity in colorectal cancer. MMP-7 may become a sensitive tumor marker. Inducing TIMP-2, TIMP-3 or suppressing MMP-2, MT1-MMP, MMP-7 mRNA′s expressions may inhibit the invasion and metastasis of cancer.
【Key words】 Colorectal neoplasm； Metalloproteinases； Tissue inhibitor of metalloproteinases
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是细胞外基质降解过程中最重要的蛋白水解酶类，参与机体的许多生理和病理过程，特别是与肿瘤的浸润和转移过程密切相关。目前已发现MMPs至少有20个成员，其中MMP-2又称Ⅳ型胶原酶，主要水解Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶等；MMP-7又称基质溶解素，主要降解层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、蛋白多糖、Ⅳ型胶原等；MT1-MMP即MMP-14，除作用于纤维粘连蛋白、蛋白多糖等底物外，还是MMP-2、MMP-13酶原的激活剂。MMPs的活性还受到一类内源性抑制剂——组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的调控。目前发现TIMPs有4种，其中TIMP-2特异性地与MMP-2结合，抑制其活性。不同于其他TIMPs，TIMP-3本身就是细胞外基质成分。本研究旨在探讨这几种MMPs和TIMPs在大肠癌中的表达特点及意义。
资料与方法
1．临床资料：有明确病理学诊断的28例大肠癌组织和相应正常粘膜，随机取自我院外科1998年2月至1998年11月住院手术的患者。正常粘膜距肿瘤边缘15 cm。本组病例男女各14例；年龄33～82岁；直肠癌13例，左半结肠癌8例，右半结肠癌7例；Dukes A期4例，B期6例，C期10例，D期8例。所有标本于切除后30 min内置于液氮内保存。
2．MMPs和TIMPs的检测方法：用RT-PCR方法检测。所有标本采用一步法提取组织总RNA。取5 μg组织总RNA合成cDNA第一链(M-MLV，Gibco)。取1/5逆转录体系的cDNA加2 U Taq聚合酶(华美生物工程公司产品)及相应缓冲液于50 μl体系内行PCR扩增，含引物25 pmol(赛百盛生物工程公司合成)，内参照为β-actin。94 ℃变性，72 ℃延伸，退火温度、引物序列见表1。PCR产物经2%琼脂电泳，用电泳激光密度扫描仪分析PCR产物带的积分光密度值（OD值）。
3．统计方法：采用相关分析，逐步回归，方差分析和t检验。
表1 PCR引物序列、退火温度和循环次数
引 物 序 列 片段长度(bp) 退火温度(℃) 循环次数
MMP-2 5′-CCACGTGACAAGCCCATGGGGCCCC-3′ 490
56 35
反义 5′-GCAGCCTAGCCAGTCGGATTTGATG-3′
MT1-MMP 5′-ACGGAGGTGATCATCATTGAGG-3′ 478 57 28
反义 5′-AGATGGGGCTGGACAGACACA-3′
MMP-7 5′-AGATGTGGAGTGCCAGATGT-3′ 365 57 28
反义 5′-TAGACTGCTACCATCCGACC-3′
TIMP-2 5′-GTTTTGCAATGCAGATGTAG-3′ 540 56 35
反义 5′-ATGTCGAGAAACTCCTGCTT-3′
TIMP-3 5′-TGGTCTACACCATCAAGCAGA-3′ 380 56 35
反义 5′-CATGTCGGTCCAGAGACACTCG-3′
β-actin 5′-CTGTCTGGCGGCACCACCAT-3′ 254 57 28
反义 5′-GCAACTAAGTCATACTCCGC-3′
结果
1．本组患者MMPs和TIMPs mRNA的表达率：见表2。
表2 28例患者MMPs和TIMPs mRNA的表达状况
项 目 正常组织 肿瘤组织
总例
数 阳性
例数 阳性率
(%) 总例
数 阳性
例数 阳性率
(%)
MMP-2 28 23 82.1 28 27 96.4
MMP-7 28 1 3.6 28 27 96.4
MT1-MMP 28 28 100.0 28 28 100.0
TIMP-2 28 27 96.4 28 28 100.0
TIMP-3 28 9 32.1 28 19 67.9
2．MMPs的表达特点：（1）肿瘤组织中MMP-2和MT1-MMP mRNA的表达水平高于肿瘤周围正常粘膜组织，且两者有明显的相关性(r分别为0.4690和0.7150,P<0.01)；MMP-2、MT1-MMP mRNA的表达水平与肿瘤的分期、分化程度、部位、浸润深度、淋巴结转移状况及患者的性别、年龄等因素无关(P>0.1)。（2）本组患者中，仅1例正常组织中有弱的MMP-7 mRNA表达，27例肿瘤组织中有MMP-7表达。其表达水平与Dukes分期相关，D期患者的表达水平明显高于A、B、C期的患者，差异有极显著性意义，（P<0.01)；与性别、年龄等因素无关(P>0.1，表3)。
表3 MMP、TIMP mRNA的表达水平与Dukes分期的关系(±s，OD值)
Dukes
分期 MMP-2 MMP-7 MT1-MMP TIMP-2 TIMP-3
肿瘤组织 正常组织 肿瘤细胞 正常组织 肿瘤组织 正常组织 肿瘤组织 正常组织 肿瘤组织 正常组织
A 0.78±0.17 0.78±0.46 0.41±0.14 0.00 0.46±0.09 0.42±0.15 0.73±0.58 0.53±0.29 0.45±0.66 0.31±0.26**
B 1.09±1.14 0.33±0.27 0.47±0.28 0.02±0.04 0.70±0.29 0.41±0.26 0.64±0.27 0.77±0.73 0.42±0.61 0.04±0.08
C 1.01±0.61 0.86±0.68 0.53±0.08 0.00 0.57±0.34 0.39±0.37 1.44±0.37* 0.98±0.33 0.66±0.74 0.12±0.19
D 1.48±1.21 0.99±0.69 0.70±0.11 0.00 0.56±0.19 0.27±0.15 0.99±0.40 1.28±0.63 0.40±0.42 0.00
P值 0.5870 0.2307 0.0188? 0.3113 0.5810 0.7001 0.0025? 0.1203 0.8091 0.0230?
注：*P<0.01，**P<0.05
3．TIMPs的表达特点：（1）肿瘤组织中TIMP-2 mRNA表达水平随Duke′s分期的进展而升高(表3)，但仅C期较A、B期的差异有极显著性意义（P<0.01）；淋巴结阳性患者的表达水平为(1.25±0.46)，明显高于淋巴结阴性患者的(0.75±0.41)，差异有极显著性意义（t=－2.97,P<0.01)。肿瘤周围正常组织中TIMP-2 mRNA 的表达与患者的Dukes′分期及患者的性别、年龄等因素无关。（2）肿瘤周围正常组织中TIMP-3的表达水平与患者的Dukes′分期及肿瘤浸润深度呈负相关(r分别为－0.4538和－0.4801,P<0.01)，A期患者的表达水平明显高于B、C、D期的患者，差异有显著性意义(表3，P<0.05)。
4．TIMPs与MMP之间的关系：TIMPs与MMPs mRNA的表达水平无明显相关性(P>0.05)。
讨论
基质金属蛋白酶在肿瘤生长、浸润、转移多个环节对细胞外基质和基质膜的降解起重要作用。MMPs可由肿瘤分泌(如MT1-MMP)、肿瘤间质细胞分泌(如MMP-2酶原)，而MMP-7具有特异的上皮源性，即只有上皮来源的肿瘤细胞分泌，这一特点在大肠癌的研究中具有特殊意义。
在本研究中，27例(96%)大肠癌组织MMP-7 mRNA表达阳性，正常粘膜中仅1例有弱表达,其余均为阴性，与MMP-7的分泌特点一致。同时，大肠癌组织中MMP-7 mRNA的表达水平随Dukes′分期的进展而升高，这与Mori等［1］的报道相一致，说明MMP-7与大肠癌的浸润和转移过程密切相关，并在大肠癌的进展中具有重要作用。由于MMP-7的异常表达在大肠癌中具有明显的肿瘤细胞特异性，且在大肠癌发生的早期就已出现。因此，MMP-7可望成为诊断大肠癌的一个敏感指标，并有望通过检测淋巴结中的MMP-7来判断淋巴结转移的情况。
本组患者，大肠癌组织MMP-2和MT1-MMP
mRNA的表达水平高与肿瘤周围正常组织，并与其有明显的相关性。MMP-2和MT1-MMP表达的调控机制与MMP-7不同，可能受肿瘤细胞分泌的某些细胞因子或信号的调控。MT1-MMP与MMP-2的表达具有一致的特点，提示MT1-MMP与MMP-2的表达可能具有内在联系。Sato等［2］的研究报道表明，MT1-MMP能激活MMP-2酶原，使肿瘤细胞的浸润能力明显增。Nomura等［3］经酶谱学方法结合显微解剖研究发现，MMP-2酶原只在MT1-MMP高表达的癌巢中被激活。这些研究表明，MT1-MMP可能一方面直接水解基质膜成分，另一方面通过激活MMP-2酶原引起肿瘤周围基质和基质膜中Ⅳ型胶原的降解，从而使肿瘤向周围组织浸润并进而向远处转移。针对这一机制，早期阻断MT1-MMP的表达可能会抑制肿瘤的浸润和转移，从而成为抗肿瘤治疗的一个新途径。
MMPs的活性同时还受到主要由肿瘤间质细胞分泌的一类内源性抑制剂-TIMPs的调控。Nuovo等［4］提出，在肿瘤浸润和转移过程中，MMPs/TIMPs比例失衡较单纯的MMPs或TIMPs水平的变化意义更大。
本研究中，TIMP-2的表达水平与淋巴结转移和Dukes′分期相关，其表达水平的增高反映了大肠癌淋巴结转移和肿瘤向晚期发展的情况。Murashige等［5］的研究结果与我们相似。在大肠癌早期MMP-2的表达即达高峰，而TIMP-2峰值出现较晚，两者的不同步表明这可能是一种应答效应，即肿瘤分泌的某些产物或因子刺激肿瘤间质细胞表达TIMP-2。因此，TIMP-2对MMP-2的抑制作用在大肠癌后期较强，在早期较弱。早期人工诱导TIMP-2的高表达可能对预防大肠癌转移有重要作用。
与TIMP-2不同，TIMP-3在大肠癌早期正常组织中高表达，随着病情的进展、肿瘤浸润深度增加其表达水平明显降低，提示TIMP-3可能对早期肿瘤的局限起作用，抑制肿瘤向远处浸润。由此推测，TIMP-3 mRNA随肿瘤进展而减少有可能是被肿瘤细胞分泌的产物降解，或者是TIMP-3基因转录活性降低，但这有待于进一步研究。Powe等［6］研究发现，在大肠癌的边缘，TIMP-3 mRNA表达最强，在此边缘外周，3/12的中分化腺癌有TIMP-3表达，而低分化腺癌无1例表达，并认为这种肿瘤边缘外周TIMP-3的缺失可能使低分化腺癌的浸润性增强。根据TIMP-3的生理特性和在肿瘤中的表达特点，人工诱导TIMP-3高表达可能对限制肿瘤生长和浸润有重要作用。
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