张凌 熊鸿燕 孙华明 李莉 丁亚 提要 采用3H渗入检测法、免疫电镜、ELISA法、雏鸭感染试验等技术，观察短波紫外线（UVC）与交联淀粉碘（CSI）联用对血浆中鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的灭活效果。结果，在7 170 J/m2UVC照射后，再经CSI100 mg/ml作用90 min，血浆中DHBVDNA-P活性下降99.76％，DHBV颗粒破坏，而DHBsAg为阳性，雏鸭感染比率为2/13。若CSI作用时间延长至120 min，血浆中DHBsAg滴度进一步下降但仍呈阳性，雏鸭感染比率却为0/10。 关键词 协同灭活病毒作用 血浆消毒 紫外线 交联淀粉碘 鸭乙型肝炎病毒 STUDY ON INACTIVATION OF DHBV IN PLASMA BY COMBINATION OF SHORT-WAVE ULTRAVIOLET RAYS AND CROSS-LINKED STARCH IODINE Zhang Ling （Anti-epidemic Detachment, Medical Department,General Logistics Department of CPLA, Beijing 100039） Xiong Hongyan Sun Huamin Li Li Ding Ya （aculty of Preventive Medicine, the Third Military Medical University） Abstract Using techniques such as 3H permeation examination method, immunological electronmicroscopy, ELISA and duckling infection test, the efficacy of combination of short-wave ultraviolet rays(UVC) and cross-linked starch iodine (CSI) in inactivating DHBV in plasma was observed. The results showed that after irradiation with 7170 J/m2 UVC and exposure to CSI 100 mg/ml for 90 min, the DNA-P activity of DHBV in plasma decreased by 99.76% and DHBV particles were destroyed, while DHBsAg was positive and the ratio of infection of ducklings was 2/13. If the time of exposure to CSI was prolonged to 120 min, the titer of DHBsAg in plasma decreased further, but was still positive, while the ratio of infection of ducklings was 0/10. Key words synergetic inactivation of virus plasma disinfection ltraviolet rays cross-linked starch iodine DHBV 针对血液和血液制品存在病毒污染问题，许多研究者在寻找有效、安全、经济的灭活其中病毒的方法〔1～5〕。熊鸿燕等曾研究了短波紫外线（UVC）和交联淀粉碘（CSI）对血浆中辛德比斯病毒（SV）的灭活效果〔6,7〕。为验证其对人乙型肝炎病毒（HBV）的效果，我们以形态、结构、抗力及传播途径等与HBV非常相似的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）为试验病毒，进行了试验观察。现将结果报道于下。 1 方法 1.1 DHBV阳性血浆的收集 从农贸市场各摊点收集新鲜鸭血，按摊点分别以枸橼酸钠溶液抗凝，收集血浆。每摊点血浆各取1 ml，用ELISA法和3H -dTTP渗入法分别作鸭乙型肝炎病毒表面抗原（DHBsAg）和DHBVDNA多聚酶（DNA-P）活性的检测。将DHBsAg强阳性，且DNA-P活性高于阴性血浆样品400 cpm以上的血浆留作试验用，存放于-70～-80℃。 1.2 血浆消毒方法 向直径20 mm的24孔细胞培养板孔中，按0.5 ml/孔加入DHBV阳性血浆。用辐照度值为2 390 μW/cm2的短波无臭氧紫外线灯产生的UVC照射5 min（照射剂量为7170 J/m2）。照射时，使细胞培养板温度控制在18～20℃，同时人工摇动，使血浆可被均匀照射。照射后收集血浆，再按100 mg/ml的量加入CSI（本实验室制备，有效碘含量为6.393 mg/g）。在室温下，以20 r/min混悬作用至预定时间，离心（4 000 r/min）1 min〔7〕。以不经UVC照射，按100 mg/ml的量加入交联淀粉（CS）后作用120 min的DHBV阳性鸭血浆作为阳性对照。均取上层血浆，进行测定和电镜观察。 1.3 DHBVDNA-P活性检测 用Milborrow等报告的HBVDNA-P测定方法进行〔8〕。在40 μl2×终浓度3H渗入液中加入32 μl待测鸭血浆，以无菌去离子水补足80 μl，混匀。置37℃水浴反应2 h，再置65℃1 min终止反应，离心(5000 r/min)10 min。取上清液60 μl点于直径24 mm滤纸圆片上。于室温下干燥后，用冰浴维持温度以5％三氯乙酸洗涤3次（每次10 min），95％乙醇洗涤2次（每次10 min）后，经80℃10 min烤干。冷却后，加入液体闪烁液，用液体闪烁计数仪测定放射性强度（cpm）。 1.4 DHBsAg测定 测定DHBsAg采用ELISA法。将鼠抗DHBsAg血清用ELISA包被液1∶200稀释，以100 μl/孔包被酶联板。4℃过夜，用PBST洗板5次。每孔加待测血浆样液100 μl，置37℃2 h，同上用PBST洗板。按100 μl/孔的量加兔抗DHBsAg血清（经抗体稀释液1∶200稀释），置37℃1 h，同上用PBST洗板。按100 μl/孔加HRP标记的羊抗兔血清（经抗体稀释液1∶1000稀释），置37℃1 h，同上用PBST洗板。每孔加底物显色液100 μl，显色10 min，再加50 μl2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪在490 nm波长处测定OD值。 .5 雏鸭感染试验 取一日龄重庆麻鸭70只，编号。分别取其颈静脉血0.5 ml作DHBsAg（ELISA法）测定。阴性血进一步作DHBVDNA（PCR法）测定。将无DHBV感染的雏鸭随机分成4组：① 阳性对照组，按100 μl/只的量从静脉注入经CS处理的DHBV阳性血浆；②、③、④为试验组，从静脉注入同样量的经7170 J/m2UVC照射后CSI作用的DHBV血浆。② CSI作用30 min，③ CSI作用90 min，④ CSI作用120 min。于注入血浆后第7、14、21 d，分别采血，进行DHBsAg测定。此项阴性血进一步作DHBVDNA测定。有一项阳性即为有DHBV感染。 1.6 电镜观察病毒颗粒形态 观察采用固相免疫电镜法，按Katz等报告的方法〔9〕制备样品。将鼠抗DHBsAg血清（含抗体3.4 mg/ml）作1∶10稀释，取5 ml，与等量已预处理的金黄色葡萄球菌悬液混合（37℃，15 min），使细菌致敏。离心（3200 r/min）1.5 min后，用0.01％叠氮钠洗涤，再次离心并重悬于3 ml0.01％叠氮钠中，备用。 取待观察样液0.5 ml，与等量致敏菌液混合，于37℃孵育40 min，其间反复摇动。离心（4000 r/min）2 min，重悬于0.5 ml0.01％叠氮钠液中。加一滴混合悬液于附有Formvar膜的铜网上，置37℃干燥，再用2％磷钨酸染色3～5 min。用透射电镜，在45 kV条件下观察病毒颗粒形态。每个样本观察15～20个视野。 2 结果 2.1 UVC与CSI联用法对血浆中DHBV的灭活作用 更多相关文档请点击>>病毒(1312)研究(6533)血浆(401)DHBV(2)CSI(4)UV(4)min(268)作用(2694) |
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