珍屯医学

标题: 人体喉部的功能性组织解剖学 23-12: 组织干细胞与人声带黏膜的干细胞龛 [打印本页]

作者: 大江 时间: 2018-9-29 08:04
标题: 人体喉部的功能性组织解剖学 23-12: 组织干细胞与人声带黏膜的干细胞龛
概要

1.最新研究表明，人体黄斑中的声带星状细胞参与细胞外基质的代谢，这对于人声带粘膜的粘弹性是必需的。另外，声带星状细胞被认为是人类声带粘膜的生长，发育和衰老中的重要间质细胞。

2.声带状星状细胞被认为是人类声带中的一类新细胞。尚不确定声带星状细胞是否来自与成纤维细胞相同的胚胎来源。

3.越来越多的证据表明，包括斑点状黄斑中的声带星状细胞的细胞是人类声带的组织干细胞，而斑块状黄斑是干细胞生态位的候选者。

4.包括人成体斑块中的声带星状细胞的细胞具有所有三个胚层的蛋白质。这表明细胞是未分化的并且具有多能性。

5.斑块状黄斑中细胞的放射敏感性很高，表明细胞尚未像成纤维细胞那样完全分化。

6.端粒酶位于斑块状黄斑中的细胞中。它们是静止细胞（G0期）。

7.人类成年斑黄斑中的细胞分裂反映了不对称的自我更新，培养的细胞形成集落形成单位。因此，该现象导致人黄斑中的细胞很可能是组织干细胞。

8.最近的研究表明，人体黄斑中的细胞不是来自声带粘膜的常驻间质细胞，而是来自骨髓细胞通过外周循环的分化。

9.出生时，细胞已经从骨髓供应到新生儿声带中的黄斑中，并准备开始作为振动组织的人声带粘膜的生长和发育。

10.黄斑中的乙酰透明质酸浓度很高，并含有具有透明质酸受体的细胞，表明斑黄疣是富含透明质酸的基质，这是干细胞生态位所必需的。

11.在人类声带粘膜的斑块状黄斑中适当的微环境必须有效地作为保持所含组织干细胞的干性的干细胞生态位。

12.1简介

干细胞是细胞的一个子集，具有通过自我更新补充自身的独特能力以及分化成不同类型的成熟细胞的潜力。因此，这些特征在胚胎发育和组织再生期间的器官发生中起重要作用。干细胞有两种主要类型：胚胎和成体。随着发育的进行，出现了器官发生的需要，并且胚胎形成用于生殖的种系干细胞和用于器官发生的体干细胞。

出生后，成体干细胞（包括种系干细胞和体干细胞）存在于称为“生态位”的特定微环境中，其根据组织类型在性质和位置上变化。这些成体干细胞是组织稳态的重要组成部分;它们支持正在进行的组织再生，取代由于天然细胞死亡（细胞凋亡）或损伤而损失的细胞。

在另一种分类系统中，干细胞根据它们分化的潜力分为两个主要组，多能和多能。多能（胚胎）干细胞可以分化成体内的各种细胞，而多能（成人）干细胞可以分化成多个但不是全部的细胞谱系。

成体组织特异性干细胞（组织干细胞，体干细胞）具有自我更新和产生功能分化细胞的能力，这些细胞补充在整个生物体的整个生命过程中丢失的细胞。组织特异性干细胞存在于生态位中，由此复杂的微环境维持其多能性。

在我们的实验室于2001年发现了在人类黄斑中具有星形外观的间质细胞。这些细胞具有脂滴并储存维生素A.它们与人类声带粘膜中的成纤维细胞有许多形态学差异，并且不断合成对于人声带粘膜的粘弹性必不可少的细胞外基质。这些细胞没有命名法，因此在我们之前的一系列研究中被指定为声带星状细胞。

最新研究证实，人体黄斑中的声带星状细胞参与细胞外基质的代谢，这对于人类声带粘膜的粘弹性特性是必不可少的。声带星状细胞被认为是人类声带中的一类新细胞，并且被认为是人类声带粘膜的生长，发育和衰老中的重要间质细胞。

我们的另一项研究显示，人类斑块状黄斑中的声带星状细胞是具有核周维生素A液滴的结蛋白阳性细胞，并显示出所提出的“弥漫星状细胞系统”中包含的细胞的形态特征。

尚不确定声带星状细胞是否来自与人声带粘膜中的成纤维细胞相同的胚胎来源。

作为最新研究的结果，有越来越多的证据表明，人类黄斑病中包括声带星状细胞的细胞是人类声带粘膜中的成人多能干细胞，组织干细胞或祖细胞。黄斑是干细胞生态位的候选者，这是一种培养干细胞库的微环境。

关于如何调节人体黄斑中包含的这些细胞的研究是具有挑战性的，但在人类声带的再生医学领域中是重要的。

不仅对细胞而且对其微环境的操纵是再生医学的策略之一。使用尖端方法（例如，通过化学生物学）对这些细胞进行人工操作可以导致声带再生的高级发展。了解负责细胞微环境调节的机制，包括人类黄斑中的声带星状细胞，将提供通过其微环境操纵细胞所需的工具，用于开发治疗疾病和组织损伤的方法。转化医学的重点是如何调节细胞和声带黄斑中包含的细胞外基质（微环境）将有助于我们恢复和再生人类声带组织的能力。

12.2人类成年黄萎病菌中细胞的中间丝

蛋白质在细胞质的中间丝中的表达对细胞类型和分化是特异性的。由于中间丝的组织特异性，可以基于存在的中间丝蛋白区分来自不同组织的细胞。

微丝分布在人体黄斑中的细胞的细胞质中，并且还存在10nm厚的细丝（中间细丝）（图12.1）。

中间丝中的蛋白质包括细胞角蛋白（图12.2a），波形蛋白（图12.2b），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（图12.2c）和结蛋白（图12.2d）分布在细胞质中。细胞包括成年斑黄斑中的声带星状细胞。细胞角蛋白是上皮细胞的中间丝的蛋白质，波形蛋白是间充质细胞的中间丝的主要亚基蛋白。胶原纤维酸性蛋白，中间丝蛋白家族的成员和神经嵴细胞的特征，在星形胶质细胞和中枢神经系统中的某些其他星形胶质细胞中大量且特异性地表达。此外，神经干细胞经常和强烈表达神经胶质原纤维酸性蛋白。结蛋白是中间丝的蛋白质，是肌原性嵴细胞的特征，存在于肌细胞中。

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图. 12.1  人体黄斑中细胞的细胞质中的微丝（中间细丝）的透射电子显微照片（乙酸铀酰和柠檬酸铅染色）

另外，人黄斑中的细胞表达SOX17（图12.3），其是内胚层细胞标记物。

因此，人成体黄斑中的细胞表达所有三个胚层的蛋白质。这表明它们是未分化的细胞并具有多能性。

尚不确定人类成人黄斑中的细胞是否来自与人类声带中的成纤维细胞相同的胚胎来源。

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图. 12.2  人类黄斑中细胞的免疫组织化学染色。（a）细胞角蛋白，（b）波形蛋白，（c）胶质纤维酸性蛋白，（d）结蛋白

12.5人成年黄斑细胞的细胞周期

定义为Ki-67的抗原是人核蛋白，其表达与细胞增殖密切相关，并且在常规病理学中广泛用作测量细胞生长分数的增殖标记[16]。细胞在细胞周期中增殖期间表达Ki-67（G1-，S-，G2-，M-期），但处于停滞状态（G0期）的细胞不表达Ki-67。

包括斑块状黄斑中的声带星状细胞的细胞不表达Ki-67（图12.5），表明它们是静息细胞（G0-相），干细胞也是如此。

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图. 12.3  通过免疫组织化学染色显示，在人黄斑中的细胞中检测到SOX17

12.3人类成年黄萎病菌中细胞的放射敏感性

包括星形黄斑中的声带星状细胞在内的细胞的放射敏感性在形态学上高于人声带粘膜的Reinke空间中的成纤维细胞（第11章），表明细胞尚未像成纤维细胞那样完全分化。

12.4人类成年黄萎病菌中细胞的端粒酶

称为端粒酶的特殊DNA聚合酶可以催化端粒重复序列的额外拷贝的形成，从而补偿DNA复制过程中染色体两端发生的逐渐缩短。在多细胞生物中，端粒酶主要存在于产生精子和卵子的生殖细胞中，以及一些其他种类的增殖正常细胞如干细胞中。由于在大多数细胞中未发现端粒酶，因此每个细胞分裂时其染色体端粒越来越短。端粒酶的存在允许细胞无限分裂而不会发生端粒缩短。

包括斑点状黄斑中的声带星状细胞的细胞表达端粒酶逆转录酶（图12.4），表明称为端粒酶的特殊DNA聚合酶存在于黄斑中的细胞中。这进一步表明人类黄斑中的细胞是人声带粘膜中的组织干细胞。

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图. 12.4  通过免疫组织化学染色显示在人黄斑病毒细胞中的细胞中检测到端粒酶逆转录酶

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图. 12.5  人体黄斑中的细胞不表达Ki-67（免疫组织化学染色）

12.6人类成年黄萎病菌与周围组织之间的过渡区

斑点状黄斑与其周围组织之间的过渡区域很有趣。

后黄斑附着于杓状软骨的声音过程后方。位于声音过程尖端的弹性软骨有助于在内收和外展过程中发声过程。黄斑后黄斑和声带过程的弹性软骨部分之间的细胞和细胞外基质的转变是渐进的，并且它们之间的边界没有清楚地描绘（图12.6）。后黄斑中的细胞似乎在声音过程的尖端分化成软骨细胞。

人黄斑中的细胞表达CD44（间充质干细胞标记物）。斑块状黄斑周围组织中的大多数成纤维细胞不表达CD44。然而，在斑块黄斑的外围观察到CD44阳性成纤维细胞（图12.7）。黄斑黄斑中的细胞似乎分化成周围组织中的成纤维细胞。

这些发现提高了包括斑块状黄斑中的声带星状细胞的细胞产生功能分化细胞的可能性，例如人声带粘膜中的软骨细胞和成纤维细胞。需要进一步研究以确定包括斑块状黄斑中的声带星状细胞的细胞是否具有自我更新的能力并产生功能分化的细胞（多能性），其在整个生物体的整个寿命期间补充丢失的细胞。

12.7人黄斑中细胞的细胞分裂

人体黄斑的体外培养产生了有趣的结果。

在显微镜下从手术标本中提取人声带粘膜的黄斑后，将黄斑黄斑在培养基中切碎，培养和增殖。

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图. 12.6  人成人后黄斑黄斑与杓状软骨发声尖端之间的过渡区域。（a）后黄斑和声带过程的尖端。（b）后黄斑和声带尖端之间的过渡。（c）黄斑后部黄斑。（d）声音过程的弹性软骨部分

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图. 12.7  人类成人后部黄斑黄斑和周围组织之间的边界（CD44，免疫组织化学染色）。清楚地描绘了包含声带星状细胞和周围组织的密集质量黄斑黄斑之间的边界（星号）。在人黄斑的外周观察到CD44阳性成纤维细胞

在MF-start原代培养基（Toyobo，Osaka，Japan）中进行了几周的原代培养后，两种类型的细胞，成纤维细胞样梭形细胞（A组）和鹅卵石状 - 如鳞状细胞（B组），生长从黄斑黄斑片段（图12.8）。鹅卵石状鳞状细胞呈多边形，具有椭圆形核（图12.8c）。细胞核 - 细胞质比率高。

在通过细胞刮刀除去两种类型的细胞后，将每种类型的细胞单独传代培养在MF-培养基（间充质干细胞生长培养基）（Toyobo，Osaka，Japan）中以增殖细胞。

在第一次传代培养一周后，传代培养的A组细胞变成星状并具有细长的细胞质过程（图12.9a）。细胞质中存在小的脂滴。细胞核呈椭圆形，核 - 细胞质比例低。这些细胞在形态上与声带星状细胞相似。

在第二次传代培养一周后，传代培养的B组细胞形成集落形成单位（图12.9b），表明这些细胞是骨髓中的间充质干细胞或基质干细胞。

菌落形成是干细胞的特征之一。 Friedenstein等人首先描述了体外集落形成单位。他们确定，可以从骨髓基质中分离出形成细胞集落的体外培养的贴壁成纤维细胞。该菌落形成单位可以分化成软骨，骨骼和脂肪组织。在胚胎干细胞（ES细胞），诱导的多能干细胞（iPS细胞）和诸如肝干细胞和肾祖细胞的组织干细胞或祖细胞中也观察到这样的集落。因此，集落形成现象使得人类斑块状黄斑中的细胞（包括声带星状细胞）成为组织干细胞的可能性。

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图. 12.8  用MF-start原代培养基（Toyobo，Osaka，Japan）进行黄斑黄斑的原代培养（相差显微镜）。（a）两种类型的细胞，鹅卵石样鳞状细胞和成纤维细胞样梭形细胞，从原代培养物中的黄斑黄斑片段生长。（b）成纤维细胞样梭形细胞。（c）鹅卵石状鳞状细胞

如上所述，具有间充质干细胞生长培养基的人成体黄斑中的细胞分裂反映了不对称的自我更新（图12.10）。干细胞生态位中的不对称性是指子细胞彼此不同的概念。有大量证据表明，许多干细胞分裂导致一个子细胞与亲本细胞相似，因此，必然允许干细胞表型的自我更新，而另一个子细胞是分化的或承诺的细胞。类型。细胞分裂中的不对称性导致人成体声带中的斑点状黄斑是包含组织干细胞的干细胞小生境的可能性。

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图. 12.9  在MF-培养基（间充质干细胞生长培养基）（Toyobo，Osaka，Japan）中对每种细胞进行单独传代培养以增殖细胞（相差显微镜）。（a）星状细胞。原代培养物中的成纤维细胞样细胞在形状上变成星状细胞，并且在传代培养中具有细长的细胞质过程和细胞质中的小脂滴。（b）菌落形成单位。 MF培养基中的鹅卵石状鳞状细胞形成菌落形成单位

12.8人类黄斑中组织干细胞的层次结构

这里出现的问题是，声带星状细胞是组织干细胞还是祖细胞（转运扩增细胞）。

集落形成的传代培养细胞（鹅卵石样鳞状细胞）（图12.11）和非集落形成的亚培养细胞（成纤维细胞样梭形细胞）（图12.12）表达细胞质细胞角蛋白（上皮相关蛋白），波形蛋白（间充质细胞相关蛋白），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（神经相关蛋白）和结蛋白（肌肉相关蛋白）。因此，集落形成细胞（鹅卵石样鳞状细胞）和非集落形成细胞（成纤维细胞样梭形细胞）均表达外胚层和中胚层胚层。这表明它们是未分化的细胞并具有多能性。

声带星状细胞可能是转运 - 扩增细胞，即祖细胞。然而，在目前的研究状态下，很难澄清干细胞系统和人类黄斑中的干细胞层次，并确定声带星状细胞是组织干细胞还是祖细胞。

12.9 黄斑的微环境作为人类声带折叠中的干细胞生态位

12.9.1富含透明质酸的基质

赋予多细胞生物细胞干性的结构和生物化学微环境被称为干细胞生态位。干细胞生态位由特定组织位置的一组细胞组成，用于维持干细胞。

透明质酸作为众多干细胞群的重要利基成分。透明质酸发现后，人们认为其主要功能是组织的生物物理和稳态特性。然而，目前的研究使人们认识到透明质酸在细胞行为中也起着至关重要的作用。富含乙酰透明质酸的基质由糖胺 - 神经糖醇透明质酸及其跨膜受体（细胞表面透明质酸受体）组成，能够直接影响干细胞生态位中干细胞的细胞功能。

人类成人声带中的斑点黄斑在pH 2.5下用阿尔新蓝强烈染成浅蓝色（图12.13），并且注意到在pH 1.0下用阿尔新蓝染色相对稀疏。包括声带星状细胞在内的细胞周围的基质物质以相同的方式染色。用透明质酸酶消化用Alcian Blue（pH 2.5）强烈染色的黄斑黄斑中的材料。大量的糖胺聚糖（透明质酸）位于细胞周围，并且人类成年斑中的透明质酸浓度很高。清晰地描绘了密集的透明质酸（黄斑黄斑）和周围组织之间的边界（图12.13b）。此外，大多数细胞包括斑块状黄斑中的声带星状细胞表达CD44（细胞表面透明质酸受体）

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图. 12.10  用MF培养基对斑块中的细胞进行不对称细胞分裂。人体黄斑中的细胞分裂反映了不对称的自我更新。一种类型的细胞是组织干细胞（声带干细胞），其形成集落形成单位。另一种类型是转运 - 扩增细胞（祖细胞），其形状为星状，与声带星状细胞相似

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图. 12.11  集落形成细胞（鹅卵石样鳞状细胞）的免疫组织化学

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图. 12.12  非集落形成细胞（成纤维细胞样梭形细胞）的免疫组织化学

(图. 12.14). 这表明人体黄斑是富含透明质酸的细胞周围基质。

由于人体黄斑中包含声带星状细胞的细胞具有细胞表面透明质酸受体并且被高浓度的透明质酸包围，所以斑块状黄斑是干细胞生态位的候选者，这是一种培养组织干细胞库的微环境，包括声带星状细胞。

12.9.2 黄斑中的适当微环境作为干细胞生态位

另一方面，用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Nissui，Tokyo，Japan）培养的斑块状细胞代替间充质干细胞生长培养基，其形状为星状，并具有细长的细胞质过程（图12.15）。鹅卵石样鳞状细胞不会出现。星状细胞的细胞核呈椭圆形，细胞核质比低。在原代培养物中，细胞质中存在小的脂滴;然而，这些在第二种文化中消失了。星状细胞通过将它们的细胞质过程相互连接而增殖（图12.15）。这些细胞在形态学上类似于声带星状细胞。在传代培养期间，每个细胞继续表现出相同的形态特征。

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图. 12.13  （a）人类成人黄斑（阿尔新蓝染色，pH 2.5）。大量透明质酸（糖胺聚糖）（淡蓝色染色材料）位于黄斑细胞周围，并且人成年黄斑中的透明质酸浓度高。（b）人类成人黄斑黄斑与周围组织之间的边界（阿尔新蓝染色，pH 2.5）。包含透明质酸和周围组织的黄斑密集质量之间的边界（星号）清晰划定

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图. 12.14  通过免疫组织化学染色显示CD44在细胞的细胞质上，包括人黄斑中的声带星状细胞

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图. 12.15  用Dulbecco改良的Eagle培养基进行黄斑黄斑的原代培养。星状细胞从黄斑片段生长

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图. 12.16  用Dulbecco改良的Eagle's星状细胞培养基进行对称细胞分裂。在传代培养期间，每个细胞继续呈现星状形状

这些现象表明，用Dulbecco's改良Eagle's培养基对人体黄斑进行细胞分裂反映了对称的自我更新（图12.16）。相反，具有间充质干细胞生长培养基的人类黄斑中的细胞分裂反映了不对称的自我更新（图12.10）。人声带粘膜的斑块状黄斑中的适当微环境对于保持所含组织干细胞的干性的干细胞生态位是有效的。

12.10人类黄斑病菌中细胞的来源

骨髓来源的细胞在组织发育和再生方面受到了极大的关注。骨髓来源的细胞含有骨髓来源的间充质干细胞，其是能够自我更新的多能细胞，并且被认为是循环纤维细胞的起源，其与伤口愈合和组织纤维化相关。它们在外周血液中循环，在正常条件下分布到器官。当组织受损时，它们通过细胞分化促进组织修复并根据需要迁移到受损组织中。

Bucala等人首先将循环纤维细胞描述为血源性成纤维细胞样细胞。发现它们是独特的细胞，因为它们共表达造血标记物以及I型胶原蛋白和其他间充质标记物。 CD34（造血干细胞标记物），CD45（白细胞共同抗原）和I型胶原是循环来自骨髓的纤维细胞的主要标记物。

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图. 12.17  人类黄斑中细胞的免疫组织化学染色。（a）在细胞中检测到CD34。（b）黄斑含有CD34阳性细胞。（c）人成人后黄斑与周围组织之间的边界（CD34，免疫组织化学染色）。清楚地描绘了包含声带星状细胞和周围组织的密集质量的黄斑黄斑之间的边界（星号）。在人类黄斑前外侧观察到CD34阳性成纤维细胞

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图. 12.18  通过免疫组织化学染色显示在人黄斑中的细胞中检测到CD45

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图. 12.19  通过免疫组织化学染色显示I型胶原蛋白在人体黄斑中的细胞和基质中检测到

包括人黄斑中的声带星状细胞的细胞表达CD34（造血干细胞标记物）（图12.17）。它们还表达CD45（白细胞共同抗原）（图12.18）和I型胶原（图12.19）。这些蛋白质（CD34，CD45和I型胶原蛋白）是骨髓来源的循环纤维细胞的主要标志物，存在于人体黄斑中的细胞中。

因此，人体黄斑中包括声带星状细胞的细胞很可能不是来自声带粘膜的驻留间质细胞，而是来自骨髓细胞通过外周循环的分化。

12.11声带粘膜中的侧群细胞

侧群细胞被认为是富含干细胞或祖细胞的细胞群，并被认为是组织干细胞的候选者。

在最近的一项研究中，在上皮和上皮下组织中鉴定出侧群细胞，包括前部和后部黄斑。在最近的另一项研究中，侧面人群细胞在第3天开始的受伤声带的Reinke空间中显着增加，在第7天达到峰值，然后在第14天降低回到基线值。斑黄疣中的这些细胞参与伤口愈合的早期阶段。

这里引用的两项研究表明，前部和后部黄斑病病毒包含干细胞或促细胞，这些细胞具有在组织再生中发挥重要作用的能力。另一方面，有报道提出声带成纤维细胞是位于声带粘膜中的间充质干细胞。

12.12声带折叠干细胞及其在人类新生儿声带粘膜中的生态位

新生儿在与成人声带相同的位置处具有斑点状黄斑。新生斑点状黄斑由相对密集的细胞团组成，位于双侧声带粘膜的前端和后端。新生儿黄斑中的细胞具有间充质细胞的一些特征。包括人新生斑黄斑中的声带星状细胞的细胞具有所有三个胚层的蛋白质。它们很可能是未分化的细胞，其不是来自常驻间质细胞而是来自骨髓细胞的分化。我们的研究结果与包括声带星状细胞的细胞是人类新生儿声带粘膜的组织干细胞或祖细胞的假设一致。

人类新生儿声带中的黄斑黄斑仅在pH 2.5下用阿尔新蓝轻微染成淡蓝色，并且新生斑黄疣中CD44阳性细胞的百分比不是很大。新生儿的黄斑黄斑正在获得透明质酸基质，使其成为干细胞生态位的候选者。

出生时，细胞已经可能从骨髓中提供到新生的声带中的黄斑中，并准备开始人类声带粘膜的生长和发育，作为振动组织。

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参考：Functional Histoanatomy of the Human Larynx.pdf

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