罗成义 王清华 徐如祥
【摘要】 目的 脑损伤后释放的谷氨酸通过其受体,主要是N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体而发挥神经元兴奋毒作用;通过对脑损伤后不同时期伤侧大脑皮质NMDA受体活性和含水量的测定,探讨它们之间的关系。方法 以自由落体致伤方法制作脑损伤模型,采用放射性配基结合分析法对伤后不同时间的大鼠伤侧大脑皮质NMDA受体进行测定,用干湿法测脑皮质含水量。结果 伤后30分钟脑皮质含水量开始增加,伤后6小时达高峰,伤后168小时恢复正常;NMDA受体的最大结合量(Bmax)于伤后15分钟开始升高,伤后30分钟达高峰,之后逐渐降低,于伤后6小时达最低值,以后逐步升高,伤后72小时基本恢复正常。结论 实验结果提示NMDA受体过度激活是脑损伤后早期继发性脑水肿的重要启动因素之一。
【关键词】 NMDA受体 脑损伤 脑水肿 大鼠
Relationship Between Changes of N-methyl-D-aspartate Receptor Activity on Cerebral Cortex and Brain Edema After Brain Injury in Rats LUO Cheng-yi, WANG Qing-hua, XU Ru-xiang. Dept. of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Aim To investigate the relationship between the changes of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity on cerebral cortex and brain edema after brain injury in the rats.Methods The brain injury model was made by a free-falling body. Water contents in brain cortex were measured with drying-wet method, and NMDA receptor activity was detected with a radio ligand binding assay.Results The water contents began to increase at 30 minutes and reached peak at 6 hours after brain injury. The maximal binding (Bmax) of NMDA receptor increased significantly at 15 minutes and reached peak at 30 minutes after brain injury, then decreased gradually and had the lowest value at 6 hours after brain injury.Conclusion It suggests that excessive activation of NMDA receptor may be one of the most important factors to induce the successive cerebral impairments after brain injury.
【Key words】 N-methyl-D-aspartate receptor Brain injury Brain edema Rat
已有实验表明脑损伤后早期谷氨酸大量释放产生兴奋毒作用,加重脑损伤后继发性损害［1］,但对其如何通过受体产生兴奋毒作用的机制尚不十分明了。谷氨酸受体分为五类即:(1)NMDA受体;(2)海人藻酸(KA)受体;(3)使君子酸盐(QA)受体;(4)L-2-氨基-4-磷丁酸(L-AP4)受体;(5)亲代谢型受体。脑损伤后谷氨酸主要通过NMDA受体发挥继发性损害作用［2］。为此,笔者对脑损伤后不同时期伤侧大脑皮质NMDA受体活性和含水量进行测定,以探讨它们之间关系。
材料与方法
1.主要试剂:［3H］-L-谷氨酸(［3H］-L-Glu,49Ci/mmol, Sigma), CPP(Sigma),玻璃纤维滤纸(海光69号,上海虹光造纸厂)。
2.实验动物及致伤:SD雄性大鼠100只,体重(250±30)g,随机分成正常对照、假手术对照、伤后15、30分钟、1、3、6、24、72、168小时组,每组各10只。采取自由落体致伤模型造成大鼠左顶叶局限性脑挫裂伤［3］。
3.脑皮质含水量的测定:动物断头处死后,取出全脑,自损伤区后缘取脑皮质一块,仔细去除凝血块及碎裂坏死脑组织,用电子分析天平测其脑皮质湿重,然后放于110℃烤箱烘烤24小时至恒重,取出称干重,用干湿法计算其含水量。
4.NMDA受体活性测定:断头处死动物后,于冰冷条件下迅速取伤侧皮质,去除血块及碎裂组织,加入离心缓冲液,匀浆后低速离心(600×g, 4℃)5分钟,取上清再次离心(1 500×g,4℃)10分钟,取上清于37℃水浴中孵化30分钟,然后高速离心(48 000×g,4℃)15分钟,去上清,用孵育缓冲液充分混悬沉淀,以考马斯亮兰法测定膜受体蛋白浓度(浓度为1～2mg/ml)。
按照刘永学等［4］描述的方法并略作改进测定NMDA受体活性,总结合管和非特异结合管分别加膜蛋白50μg(根据标本浓度换算成体积),与终浓度分别为4,8,12,16,20,24,28,32nmol/L的［3H］-L-Glu100μl混匀,非特异性结合管内再加CPP(终浓度为100mmol/L)100μl,两组均用孵育缓冲液补足使终体积为300μl。于25℃恒温水浴中反应30分钟,冰浴终止反应,用多头细胞收集仪将膜受体蛋白收集于玻璃纤维滤纸上,80℃烤干(1小时),置闪烁液中用2 000CA/LL型液闪仪(美国PACKARD公司)测其放射比活性。
5.统计方法:按Schachard公式对所得数据进行处理,求出Bmax和KD,用F检验进行统计分析。
结 果
脑损伤后大鼠伤侧大脑皮质含水量于伤后30分钟开始上升,6小时达高峰,然后逐步下降,伤后168小时基本恢复正常(表1)。假手术组与正常组比较无显著性差异。
表1 大鼠大脑创伤后的皮质含水量变化(±s)
组别 鼠数 含水量(%)
正常对照组
10
79.46±0.53
假手术对照组 10
79.67±0.82
伤后时间(h)
0.25 10
79.66±0.82
0.5 10
80.06±0.63**
1 10
80.70±0.63**
3 10
81.31±0.78**
6 10
81.49±0.78**
24 10
81.47±0.82**
72 10
80.43±0.36**
168 10
79.49±0.67
与正常对照组比较,**P<0.01
创伤后大鼠伤侧大脑皮质NMDA受体Bmax于伤后15分钟上升,30分钟达高峰,之后下降,6小时达最低,伤后72小时基本恢复正常;KD于伤后15分钟下降,30分钟达最低,之后又上升,至伤后6小时基本恢复正常(表2)。假手术组与正常组比较无显著差异。
表2 大鼠大脑创伤后皮质神经细胞膜
NMDA受体活性变化(±s)
组别 鼠数 Bmax(fmol/mg) KD(nmol/L)
正常对照组 10
273.77±10.39
12.28±1.62
假手术对照组 10
275.6±9.16
12.03±1.59
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