梁华平 王正国 朱佩芳 罗 艳 耿 波 徐 祥
【摘要】 目的 研究创伤对反抑制细胞（Tcs）的影响。方法 采用小鼠截肢伤模型，利用长柔毛野豌豆凝集素（VVL）分离获取Tcs细胞，以直接免疫荧光法检测Tcs细胞数目；于正常T淋转、白介素2（IL－2）、IL－2受体（IL－2R）检测系统中测定Tcs细胞的反抑制活性变化；并作光镜、透射电镜观察。结果 创伤小鼠脾脏、胸腺细胞中Tcs细胞数目下降，但肠系膜淋巴细胞中Tcs细胞数目无明显变化；创伤后Tcs细胞的反抑制活性于伤后1天即有降低，伤后4～10天降低更甚，伤后14天尚未完全恢复正常；创伤后Tcs细胞在光镜未见明显异常，透射电镜下可见胞浆空泡形成，偶见胞浆溶解并呈现裸核，伤后14天小鼠Tcs细胞可见核内假包涵体形成。结论 创伤可引起Tcs细胞数目、功能及形态结构发生不同程度的改变。
【关键词】 创伤和损伤 T淋巴细胞
Changes of Contrasuppressor T Cells in Traumatized Mice
LIANG Huaping, WANG Zhengguo, ZHU Peifang, et al.
Research Institute of Surgery, 3rd Military Medical University, Chongqing 400042
【Abstract】 Objective Effect of trauma on contrasuppressor T cells (Tcs) was studied. Methods A murine amputation injury model was used. Tcs were separated using the vicia villosa lective (VVL). Tcs number was measured with direct immunofluorescence method. Contrasuppressive activity of Tcs was determined in the measuring system of normal T lymphocyte transformation. Interleukin-2 (IL-2), IL-2 receptor (IL-2R), and morphological structure of Tcs were observed under light microscope and penetrating electron microscope. Results The number of Tcs from the spleen and thymocyte was decreased after trauma while no significant change was noticed in mesenteric lymph nodes. Contrasuppressive activity of Tcs was decreased on 1st day after trauma and became more obvious on day 4 to 10. This change did not yet return to normal on day 14. The morphological structure of Tcs was not seen abnormal under light microscope, but under penetrating electron microscope, bleb formation was seen in Tcs cytoplasm, pseudounclusion in nucleus, and rarely cytolysis with naked nucleus were observed on day 14 posttrauma. Conclusions Trauma may result in changes of Tcs in number, functions and morphological structure at various degrees.
【Key words】 Wounds and injuries T lymphocytes
严重创伤可致机体免疫功能紊乱，其中T细胞介导的细胞免疫功能受抑现象表现得尤为突出，且这一变化同伤后感染的发生密切相关［1］。因此，有关创伤与T细胞的研究正成为创伤免疫领域中的研究热点。目前有关创伤后辅助性T细胞（Th）、抑制性T细胞（Ts）的变化已有大量报道［1-3］，但创伤后反抑制T细胞（contrasuppressor T cells, Tcs）的变化情况如何尚不清楚。笔者利用小鼠截肢伤模型对此进行了探讨。
材料与方法
一、 动物模型及分组
Balb/c小鼠（本校动物所提供），雌雄各半，18～22g，6～8周龄。随机分为正常对照、伤后1，4，7，10，14天共6组，各组8只。按文献［3］的方法采用双后肢膝关节离断术制备小鼠截肢伤模型。各组动物于相应时间处死，制备脾脏、胸腺及肠系膜淋巴结细胞悬液待测。
二、 Tcs细胞数目测定
按文献［4］的方法以直接免疫荧光法进行，即在脾脏、胸腺及肠系膜淋巴细胞悬液（5×106/ml）中，加入终浓度为0.1 mg/ml的VVL－FITC（Sigma公司），冰浴 30分钟，洗涤细胞后调至原浓度，滴片，于荧光显微镜下计数200个细胞，计算阳性细胞百分率（％）。
三、 Tcs细胞、Ts细胞的分离及Tcs细胞反抑制活性测定
分别参照文献［5，6］的方法以黏附盘化法分离获取Tcs细胞、Ts细胞，以直接免疫荧光法鉴定Tcs细胞纯度>92％，以间接免疫荧光法鉴定Ts细胞纯度>95%，台盼蓝染色证明两类细胞存活率均>95%。于正常脾细胞的T淋转、IL－2诱生IL－2R表达的细胞培养系统中，同时加入Tcs和Ts细胞（均占细胞总数的10％），并设只添加Ts细胞和不添加Tcs、Ts细胞组作对照，根据Ts细胞对各指标的抑制活性及Tcs细胞对Ts细胞抑制活性的拮抗作用分别计算Ts细胞抑制率（％）和Tcs细胞反抑制率（％）。
四、 Tcs细胞形态结构观察
分离的Tcs细胞按常规处理，作光镜、透射电镜观察。
五、 数据处理
结果以平均值±标准差（±s）表示，用t检验进行统计学分析。
结 果
一、 各组Tcs细胞数目的变化
和正常对照组相比，创伤小鼠脾细胞中Tcs细胞数目于伤后4～7天明显降低；胸腺细胞中Tcs细胞数目以伤后4～10天降低最为明显；肠系膜淋巴结细胞中Tcs细胞数目的变化无统计学差异（表1）。
表1 各组Tcs细胞数目的变化（±s）
组别 鼠数 Tcs细胞数目的变化（％）
脾脏 胸腺 淋巴结
正常对照 8
8.1±1.2
9.4±1.6
8.9±1.4
伤后1天 8 9.0±1.8 9.0±2.0 9.2±2.0
伤后4天 8 6.1±1.0** 6.2±0.9** 7.8±0.9
伤后7天 8 6.9±1.3* 6.1±0.9** 8.7±1.3
伤后10天 8 7.7±1.3 6.9±1.1* 8.5±1.3
伤后14天 8 8.6±0.9 8.8±1.4 8.8±1.7
与正常对照组比较：*P<0.05 **P<0.01
二、 各组Tcs细胞反抑制活性的变化
和正常对照组相比 ，创伤小鼠Tcs细胞反抑制活性于伤后1天即有降低，伤后4～10天降低更甚，伤后14天尚未完全恢复正常（表2～4）。
表2 各组不同来源Tcs细胞在T淋转检测系统中反抑制活性的变化（±s）
组别 鼠数 不同来源Tcs细胞反抑制率（％）
脾脏 胸腺 淋巴结
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