宋尔卫 陈积圣 王金林 张磊
【摘要】 目的 研究结肠直肠癌浸润淋巴细胞Fas配基(FasL)表达与癌细胞凋亡的关系。 方法 用免疫组化方法检测86例结肠直肠癌及切缘正常大肠组织的Fas蛋白、FasL的表达；用TdT酶介导的DNA3′-OH末端 -缺口染色方法检测癌细胞的调亡指数，并分析浸润淋巴细胞FasL表达与癌细胞凋亡指数的关系。 结果 86例结肠直肠癌组织呈Fas蛋白染色阳性53例(61.6%)，正常大肠组织则未见染色，癌组织旁浸润淋巴细胞 FasL染色阳性69例(80.2%)。癌组织Fas蛋白阳性组中，浸润淋巴细胞FasL染色程度与癌细胞凋亡指数呈正相关(P<0.01)，FasL染色越强，凋亡癌细胞越多。Fas蛋白阴性组中则不存在这种相关性。 结论 癌旁浸润淋巴细胞通过其表面的FasL与大肠癌细胞表面的Fas蛋白作用，是诱导癌细胞凋亡的途经之一。提高癌细胞Fas蛋白的表达及应用特异性Fas抗体，将为大肠癌治疗提供新思路。
【关键词】 结肠直肠肿瘤； 淋巴细胞，肿瘤浸润； 抗原，CD95； 凋亡
Expression of Fas ligand on peritumoral lymphocytes and its association with apoptosis of colorectal carcinomas
SONG Erwei CHEN Jisheng WANG Jinlin et al
（Department of Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Zhongshan Medical University, Guangzhou 510120,China）
【Abstract】 Objective To study the expression of Fas ligand on peritumoral lymphocytes and its relation to the apoptosis of colorectal carcinoma. Methods The expression of Fas protein and FasL in 86 cases of colorectal carcinomas and normal colorectal tissues at the margins of resection was studied immunohistochemically. Apoptosis of cancer cells was evaluated with TUNEL method, which was then correlated with FasL expression on peritumoral lymphocytes. Results 53 (61.6%) of 86 cases of colorectal carcinoma were stained positively with Fas monoclonal antibodies, but such stain was net found in the normal colorectal tissues at the margin of resection. Peritumoral lymphocytes of 69 cases (80.2%) were stained positively with FasL antibodies. The intensity of FasL staining on peritumoral lymphocytes was positively correlated with the apoptotic index of cancer cells in the Fas positive colorectal carcinomas (P<0.01), but not in the Fas negative group. Conclusion FasL expressed on the surfaces of peritumoral lymphocytes mediates apoptosis of colorectal cancer cells by acting on its receptor, Fas protein on cancer cells. The elevation of Fas expression on cancer cells and application of specific Fas antibodies may serve as new approaches to treat colorectal carcinoma.
【Key words】 Colorectal neoplasms; Lymphocytes, tumor-infiltrating; Antigen, CD95; Apoptosis
肿瘤浸润淋巴细胞是人体免疫系统对肿瘤组织的抵抗反应，以细胞免疫反应为主。近年研究表明，细胞免疫过程的细胞毒作用主要是由效应细胞Fas配基(FasL)与靶细胞表面的Fas蛋白(CD95)结合，诱导靶细胞凋亡来介导的［1］。肿瘤浸润淋巴细胞针对肿瘤细胞的攻击机制是否也通过该途径,目前尚不清楚。我们用免疫组化法检测86例大肠癌Fas蛋白和癌旁浸润淋巴细胞FasL的表达，并分析其与大肠癌细胞凋亡的关系。
资料与方法
1．临床资料：本研究标本为1994年～1999年间，我院收治的86例结肠直肠癌患者手术切除肿瘤标本，每例同时取切缘正常大肠组织作对照。86例患者中，男46例，女40例；年龄32～88岁(平均65.4岁)；肿瘤位于盲、升结肠12例，横结肠6例，降结肠5例，乙状结肠21例，直肠42例。其中高分化腺癌19例，中分化腺癌37例，低分化腺癌12例，粘液腺癌18例。按Dukes′分期，A期24例， B期39例， C期18例， D期5例。
2．检测方法：所有标本经4%的福尔马林液固定、脱水、石蜡包埋，组织切片厚度为4 μm。分别作HE、FasL与Fas单抗免疫组化LSAB法染色和TdT酶介导的DNA3′-OH末端-缺口（TUNEL）法原位凋亡细胞染色。
免疫组化染色采用的抗FasL和抗Fas单克隆抗体由 Santa公司提供(工作浓度均为1∶25)，LSAB试剂盒由DAKO公司生产，用磷酸盐缓冲液（PBS）替代抗体作为空白对照。主要步骤如下：组织切片常规脱蜡，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，加入一抗在湿盒中室温过夜，加生物素标定的兔抗鼠IgG室温1 h，加LSAB复合物室温1 h，DAB显色，苏木素复染、透明、封片。结果判断∶免疫组化染色以细胞出现棕褐色颗粒为阳性。无着色细胞为阴性（-），染色阳性细胞<10％为弱阳性（+），10%～30％为中度阳性（++）；30%～100％为强阳性（+++）。
TUNEL法原位凋亡细胞染色按TUNEL原位凋亡细胞检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司，美国)说明书进行。切片经二甲苯脱蜡；梯度酒精至蒸馏水脱水；蛋白酶K(20 mg/ml)液化20 min；0.3%过氧化氢处理30 min；加入TUNEL液(由酶溶液与标记溶液混合)50 μl，室温下孵育60 min；再加入 Converter-POD液50 μl，室温下孵育30 min；DAB显色，苏木素复染。阳性对照以Dnasel作预处理，阴性对照以PBS代替TUNEL液。
凋亡指数(AI)测定∶以细胞出现棕褐色颗粒为阳性染色，即为凋亡细胞。每张切片各取500个癌细胞，算出其中凋亡细胞占细胞总数的百分数即为凋亡指数(AI)。
3．统计学方法∶所有数据采用t检验及方差分析进行显著性检验。
结果
1．结肠直肠癌组织细胞Fas蛋白表达和肿瘤浸润淋巴细胞FasL的表达： Fas蛋白免疫组化阳性染色主要存在于结肠直肠癌细胞的胞膜和胞浆中，呈棕褐色颗粒状(图1)；本组结肠直肠癌组织呈Fas蛋白染色阳性者53例(61.6%)，切缘正常的结肠直肠粘膜和腺体组织基本未见染色。 FasL阳性染色主要位于癌间质的浸润淋巴细胞(图2)以及切缘正常结肠直肠粘膜下的淋巴细胞(图3)，呈棕褐色；69例(80.2%)肿瘤浸润淋巴细胞呈 FasL染色阳性。切缘直肠结肠粘膜下淋巴细胞FasL阳性染色与相应的肿瘤浸润淋巴细胞相一致。肿瘤部位、病理分型及临床分期与结肠直肠癌组织Fas蛋白表达及癌旁浸润淋巴细胞FasL的表达无相关性 (P＞0.05)。
2．癌组织Fas蛋白表达与肿瘤浸润淋巴细胞FasL表达的相关性：结肠直肠癌组织Fas蛋白表达与肿瘤浸润淋巴细胞FasL表达无明显相关性（表1）。
3．肿瘤浸润淋巴细胞 FasL表达与癌细胞凋亡的相关性：原位凋亡细胞TUNEL阳性染色主要见于结肠直肠癌细胞(图4)，呈单个分布，胞核呈深褐色，胞体皱缩，有的细胞轮廓尚清楚，有的则形成凋亡小体。所有癌切缘的正常肠粘膜细胞和腺细胞均未见TUNEL阳性染色。在Fas蛋白阳性组的结肠直肠癌中，随着肿瘤浸润淋巴细胞FasL染色强度的增加，癌细胞平均凋亡指数(AI)也不断上升，差异有显著性 (P<0.01)；但在Fas蛋白阴性组的结肠直肠癌中，在不同染色强度的FasL组间，癌细胞平均凋亡指数(AI)间差异无显著性（P＞0.10）(表2)。
表1 本组患者癌组织Fas表达与癌旁浸润
淋巴细胞FasL表达的关系(例)
Fas蛋白 FasL
+ - 合计
+ 40 13 53
- 29 4 33
注：χ2=1.97,P＞0.05
表2 癌旁浸润淋巴细胞FasL染色强度与
癌细胞凋亡指数(AI)的关系
FasL
染色强度 总例数 癌组织Fas(+)组 癌组织Fas(-)组
例数 AI（%） 例数 AI（%）
- 17
13
2.23±0.97
4
2.87±1.02
+ 19 9 3.63±1.34a 10 2.54±0.83aa
++ 28 16 6.29±1.42b 12 3.27±1.21bb
+++ 22 15 8.47±1.65c 7 2.96±1.52cc
注：与FasL(-)组比较，a：t=2.85，P<0.05；aa：t=0.99，P＞0.10；
与FasL(+)组比较，b：t=5.57，P<0.01；bb:t=1.61，P＞0.10；
与FasL(++)组比较;c:t=3.95，P<0.01；cc:t=0.57,P＞0.01
讨论
肿瘤浸润淋巴细胞是指存在于肿瘤间质内以T淋巴细胞为主的一种异质性淋巴细胞群体，是机体淋巴细胞浸入到肿瘤组织内部对肿瘤的抵抗现象。它们的抗肿瘤免疫效应主要是细胞免疫反应,可引起肿瘤的退行性变［2］。本组大肠癌组织间质内可见较多的淋巴细胞浸润。但是，浸润淋巴细胞的数量与肿瘤的预后并无明显的相关性［3］，目前它们抗肿瘤的具体机制尚不完全清楚。
研究证明Fas系统介导的细胞凋亡是细胞免疫反应所致细胞毒作用的重要途径。Fas蛋白 (CD95)是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员。而Fas配基(FasL)则属于肿瘤坏死因子家族，主要存在于效应免疫细胞表面。在细胞毒淋巴细胞介导的细胞免疫反应中，效应淋巴细胞表面的FasL与靶细胞表面的Fas蛋白结合，从而导致靶细胞凋亡［1］。研究证明多种实体肿瘤，如肺癌、前列腺癌和肾癌等均有Fas蛋白的表达，结肠癌细胞株HCRC也有较高的Fas基因表达［4-7］。但目前有关大肠癌组织Fas蛋白表达的报道不多。本研究中结肠直肠癌Fas蛋白阳性率达61.6%，它们主要分布于癌细胞的胞膜中，与肿瘤的分型、分期和部位无关。我们还发现，大肠癌内浸润的淋巴细胞有较强的FasL表达，FasL阳性的淋巴细胞不仅分布于癌组织旁，也见于切缘正常的大肠粘膜下和腺体旁。FasL的表达与癌细胞Fas蛋白表达并无相关性，可见它并非由靶细胞Fas表达所诱导。研究发现正常结肠上皮内淋巴细胞Fas基因的mRNA和蛋白均阳性［8］，说明FasL自然存在于结肠内的淋巴细胞。本组Fas阳性的大肠癌旁浸润淋巴细胞 FasL的染色强度，也即相对表达量与癌细胞凋亡指数呈正相关，浸润淋巴细胞FasL表达越强，癌细胞凋亡越多。我们认为癌旁浸润淋巴细胞通过其膜表面的FasL与癌细胞表面的Fas蛋白相互作用，诱导癌细胞凋亡。但Fas阴性组的大肠癌则未见这种现象，因为它们不表达Fas蛋白，故没有受到淋巴细胞表面的FasL攻击。癌切缘正常大肠粘膜下也有FasL阳性的淋巴细胞，但由于正常大肠粘膜和腺细胞无Fas蛋白表达，故并不发生凋亡。Strater等［9］的研究证明，正常直结肠粘膜不表达Fas蛋白，若出现该蛋白的异常表达，则会导致肠粘膜细胞凋亡，发生溃疡性结肠炎。因此我们认为，在癌肿局部应用较高质量的Fas特异性单克隆抗体或具有FasL高表达的淋巴细胞，或采用转基因手段，诱导癌细胞表达高水平的Fas蛋白，将成为治疗大肠癌的新策略。
图1 原发性结肠癌组织Fas蛋白免疫组化染色阳性一 LSAB法×400
图2 结肠癌旁浸润淋巴细胞FasL免疫组化染色阳性 LSAB法×200
图3 切缘正常结肠腺体旁淋巴细胞FasL免疫组化染色阳性 LSAB法×400
图4 结肠癌细胞原位凋亡细胞染色阳性 TUNEL法×200
作者单位：宋尔卫（广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科 510120）
陈积圣（广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科 510120）
王金林（广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科 510120）
张磊（广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科 510120）
参考文献
1，Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science,1995, 267: 1449-1456.
2，Halapi E. Oligoclonal T cells in human cancer. Medical Oncology,1998, 15:203-211.
3，Kelly MD, King J, Cherian M, et al. Randomized trial of preoperative cimetidine in patients with colorectal carcinoma with quantitative assessment of tumor-associated lymphocytes. Cancer,1999, 84:1658-1663.
4，Koomagi R, Volm M. Expression of Fas (CD95/APO-1) and Fas ligand in lung cancer, its prognostic and predictive relevance. Int J Cancer, 1999, 84:239-243.
5，Costa-Pereira AP, Cotter TG. Camptothecin sensitizes androgen-independent prostate cancer cells to anti-Fas-induced apoptosis. Br J Cancer,1999, 80:371-378.
6，Roman S, Petrusca D, Moldovan I, et al. Evaluation of apoptosis of tumor and of apparently normal cells in human renal carcinoma. Immunol Lett ,1999, 67:15-22.
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