郑军 姚榛祥
【摘要】 目的 观察bcl-2反义寡核苷酸（oligonucleotides,ODN）对MCF-7细胞内bcl-2表达及细胞凋亡的影响。 方法 电转染法将合成的针对bcl-2 mRNA的反义ODN导入MCF-7乳腺癌细胞，用荧光显微镜、电镜、免疫组化法及流式细胞仪检测反义ODN对乳腺癌细胞凋亡、bcl-2表达及细胞周期的影响。 结果 经bcl-2反义ODN作用后，MCF-7细胞bcl-2基因表达降低、凋亡细胞数增多,作用前后差异有显著意义（P＜0.05）；G0～G1期细胞减少，而G2～M期、S期细胞增多。 结论 bcl-2反义ODN经电转染法导入乳腺癌细胞后，可以获得较好的瞬时表达，降低bcl-2功能，促进细胞凋亡。在肿瘤研究中，bcl-2可作为一个有用的靶基因。
【关键词】 乳腺肿瘤 肿瘤细胞，培养的 癌基因 寡核苷酸类，反义 凋亡
Apoptosis increased by bcl-2 antisense ODN in MCF-7 cell line
ZHENG Jun, YAO Zhenxiang.
Department of General Surgery, Clinical College, Chongqing Medical University, Chongqing 400016.
【Abstract】 Objective To study the effects of bcl-2 antisense oligonucleotides(ODN) on the expression of bcl-2 and apoptosis in MCF-7 cell line. Methods Artificially synthesized bcl-2 specific antisense OND was introduced into MCF-7 cells by gene pulser electroprotocol. Fluorescence microscope, electron microscope, immunocytochemical staining assay, and FCM were used to detect the effects on cell apoptosis, expressional level of bcl-2 protein and cell cycle after transfecting bcl-2 antisense ODN. Results The number of apoptotic cells was increased and expression of bcl-2 protein was declined (P＜0.05). FCM showed that the number of G0-G1 phase cells was decreased and the number of G2-M, S phase cells were increased. Conclusions The effective transient expression of bcl-2 antisense ODN can be obtained by gene pulser electroprotocol in MCF-7 cell, the function of bcl-2 gene was declined and the number of apoptotic cells was increased after transfecting bcl-2 antisense ODN. bcl-2 may be used as an useful target in tumor research.
【Key words】 Breast neoplasms Tumor cells, cultures Oncogenes Oligonucleotides,antisense
Apoptosis
我们采用电转染技术将bcl-2反义寡核苷酸(ODN)导入MCF-7乳腺癌细胞内，探讨其对肿瘤细胞bcl-2基因表达、细胞凋亡及细胞周期的影响。
材料与方法
1．MCF-7乳腺癌细胞株的培养：将MCF-7乳腺癌细胞株置于含体积分数0.1新生小牛血清、160 mU/L人胰岛素的RPMI 1640培养基中培养，37 ℃、5% CO2孵箱内贴壁生长3～4代后取指数生长期细胞，以每瓶(1×105)～(2×105)细胞数种于50 ml培养瓶内，加入无血清RPMI 1640培养基培养24小时，使细胞同步化后，再加入完全培养基培养24小时，待作转染用。
2．bcl-2反义ODN制备：按文献［1］方法。
3．bcl-2反义ODN导入MCF-7细胞方法：仪器为Bio-Rad公司基因脉冲电转染仪。选择生长良好的细胞至50％～75％满底后，按文献［2］的方法将bcl-2反义ODN导入MCF-7细胞，再分别转入24孔板(每组转3孔)及培养瓶内，37 ℃、5％的CO2孵箱中培养48小时待检测。
本实验共分为5组。A组：无关ODN对照组；B组：加入反义ODN 10 μg（12.5 μg/ml）；C组：加入反义ODN 20 μg（25 μg/ml）；D组：加入反义ODN 30 μg（37.5 μg/ml）；E组：空白对照组。
4．反义ODN处理前后凋亡细胞的检测：参照张亚历等［3］的方法计数凋亡细胞，将吖啶橙（AO）配成100 μg/ml的贮存液，用时从培养瓶消化约95 μl的转染细胞悬液，加5 μl的AO贮存液混匀后作细胞点片，加盖玻片后直接在荧光显微镜下观察细胞。核固缩为圆点、新月形、杆状者为凋亡细胞；各实验组随机数200个细胞/高倍视野，计算凋亡细胞的百分率,每组均重复转染3次，分别观察后取均值。另各组取1.0×105个细胞悬液，2?000 r/min离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀用2％戍二醛固定2小时送电镜检查，观察凋亡细胞及凋亡小体。
5．bcl-2蛋白表达的检测：每实验组各取1孔贴壁生长较好的转染细胞，固定后分别进行SP法免疫组化染色，显微镜下随机计数200个细胞/高倍视野，观察bcl-2蛋白表达阳性细胞的比率，每组仍为重复转染3次，分别检测后取均值。
6．细胞周期的检测［4］：每组各取1例，用0.2%胰酶将贴壁细胞消化为单细胞，再以培养基中和胰酶，室温1000 r/min离心5分钟，弃上清液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次。用PBS配制成5×104个细胞/ml的悬液，2小时内用流式细胞仪（FCM）测试细胞周期。
7．统计方法：用SAS软件，数据用t检验。
结果
1．bcl-2反义ODN导入后MCF-7细胞凋亡状态的变化：经电转染后A组及E组仅有较少的凋亡细胞，两者差异无显著意义(P＞0.05)；而B、C、D各组凋亡细胞明显增高，与无关对照组比较差异有显著意义(P＜0.05，表1)；但B、C、D组之间差异无显著意义(P＞0.05)。电镜下见凋亡细胞包膜皱缩，表面有脱落小体，胞浆基质浓缩，电子密度增高，胞质内有大小不一的空泡，但细胞器正常。可见核断裂、并皱缩、体积缩小及染色质凝集的凋亡小体。
表1 各组凋亡细胞百分率(±s)
分 组 凋亡细胞(%) t P值
A组 11.50±3.90△
1.25 ＞0.05
B组 33.33±4.07? 6.71 ＜0.05
C组 33.00±5.51? 5.41 ＜0.05
D组 35.00±10.50? 3.63 ＜0.05
E组 8.50±1.51
注：△与E组比较P＞0.05，?与A组比较P＜0.05
2．bcl-2反义ODN处理前后乳癌细胞内bcl-2蛋白表达：无关ODN的A组细胞内bcl-2蛋白表达的阳性率为（81.16±9.22）%，空白对照的E组细胞内bcl-2为（79.25±6.60）%，两者差异无显著意义(P＞0.05)；而经不同浓度bcl-2反义ODN转染后的B组bcl-2为（43.00±12.12）%、C组为（21.50±4.58）%、D组为（22.83±9.29）%，均较A组明显减少，差异有显著意义(P＜0.05)，尤以C组和D组降低明显。
3．bcl-2反义ODN作用后细胞周期的变化：结果显示bcl-2反义ODN作用后，G0～G1期细胞数下降，G2～M期及S期细胞数增多(表2)。
表2 反义ODN作用前后各组细胞周期变化(%)
分 组 细 胞 周 期
G0～G1 G2～M S
A 组 71.03 4.50
24.43
B组 60.17 10.39 29.44
C组 56.25 13.09 30.66
C组 52.49 15.38 32.13
讨论
1．bcl-2反义ODN对肿瘤细胞凋亡的影响：细胞的凋亡如同细胞的增殖一样受多种基因,如bcl-2、c-myc、p53等调控［5］。Hockenbery等［6］认为bcl-2基因族在细胞凋亡调控中的作用最具重要意义，而且近年研究也发现bcl-2在肿瘤中的高表达可以使肿瘤细胞耐药性增高。因此，有学者研究用针对bcl-2 mRNA的反义ODN抑制bcl-2基因功能。如Keith等［7］用bcl-2反义ODN作用于急性髓系白血病细胞，发现肿瘤细胞生长受抑制。本研究结果显示：MCF-7乳癌细胞通过电转染法导入bcl-2反义ODN后肿瘤细胞凋亡增加，并随着导入ODN浓度的增加凋亡细胞数增多，至37.5 μg/ml时达最高峰，同时bcl-2蛋白表达下降。因此采取电转染bcl-2反义ODN方式可以获较好的瞬时表达、促进肿瘤细胞凋亡。
2．bcl-2 反义ODN对肿瘤细胞周期的影响：bcl-2基因除抑制细胞凋亡、延长细胞生存外, 近年研究表明该基因还具有细胞周期抑制功能。若bcl-2过度表达，可明显地促使细胞从自我更新复制进入G0期。经电转染方式将bcl-2反义ODN 导入MCF-7细胞，48小时后FCM检测发现G0～G1期细胞含量由对照组的71.03％降到52.49％，而G2～M和S期细胞则分别从4.5%、 24.43％增至15.38％、32.13％。表明bcl-2反义ODN转染导致bcl-2抑制细胞周期的功能降低，使处于G0期的细胞重新进入细胞周期循环，是肿瘤细胞凋亡的重要机制之一。bcl-2可以作为肿瘤基因治疗中有用的靶基因。
作者单位：400016 重庆医科大学临床学院普外科
参考文献
1 张涛，孙秉中，王成济，等.反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞中bcl-2基因表达的研究.第四军医大学学报，1996，17:132-134.
2 卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.396-397.
3 张亚历，姜泊，周殿元．编程性细胞死亡及研究方法.细胞生物学杂志,1995，17：127-129.
4 司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养.北京：世界图书出版公司，1996.300-301.
5 Korsmeyer SJ. bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulations of cell death. Blood, 1992,80:879-886.
6 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death.Nature, 1990,348:334-336.
7 Keith FJ, Bradbury DA, Zhu YM, et al. Inhibition of bcl-2 with antisenes oligonucleotides induces apoptosis and increases the sensitivety of AML blasts to Ara-C. Leukemia, 1995,9:131-138.
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