柳大烈 张选奋 鲁开化 李荟元 郭树忠 于鹏
摘要：目的 观察干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ ）对兔耳创面愈合期伤口周边组织和肉芽组织中蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinas e, PTK）活性以及伤口愈合时间的影响，探讨IFN-γ外用于皮肤创面的信号传导机制。方法 在兔耳腹侧伤口外用IFN-γ，观察上皮化的时间并测定正常兔耳、 伤后1天、3天、6天和创面上皮化时（12～14天)组织中PTK活性变化。结果 周边和肉芽组织中PTK活性伤后均高于正常皮肤组织（P＜0 .01），周边组织伤后6天即恢复正常水平，而肉芽组织在上皮化后仍然较高。IFN-γ可使伤 口周边和肉芽组织的PTK活性升高（P＜0.05或0.01）。IFN-γ可使 伤口愈合延迟1.23天(P＜0.01)。结论 创 伤愈合组织中PTK活性升高且与增生程度相关。PTK既介导生长刺激信号使细胞增殖和合成物 质的功能增强，也介导IFN-γ的信号使愈合延迟。
关键词：信号传导； 创伤愈合； 蛋白酪氨酸激酶； 干扰素-γ
中图分类号：R318．0 文献标识码：A
文章编号：1004-6526(2000)05-0266-03
Effects of interferon-γ on activity of protein tyrosine kin ase in wound margin tissue and granulation tissue of rabbit ear
LIU Da-lie ZHANG Xuan-fen LU Kai-hua, et al
（Department of Plasti c Surgery,The Shenyang General Hospital of PLA, Shenyang 110015，China）
Abstract:Objective By observing the changes of activity o f protein tyrosine kinase (PTK) in wound margin tissue and granulation tissue of rabbit ear and speed of wound healing after using IFN-γ to research the mechan ism of IFN-γ effecting. Methods IFN-γ was applied on the wound of rabbit ear. The PTK activity in the tissue from 1d, 3d, 6d after wound epithelization and in normal skin were measured by phosphorus (32p) incopo ration. The time of epithelialization was also observed. Results The PTK activity in wound margin tissue and granulation tissue was obviou sly elevated in comparing with that of normal skin (P＜0.0 1). PTK activity of wound margin tissue recovered to basic level after 6d wh ile that of granulation tissue still maintained at higher level (P＜0.05). IFN-γ could increase PTK activity(P＜0.0 1) and delay wound healing(P＜0.01). Conclusion PTK activity in wound healing might be related to healing rate. Th e increase of PTK activity by IFN-γ suggested that PTK not only might cmediate the stimulating signal of the growth factor family but also the signal of IFN- γ to delay wound healing.
Key words:Signal Transduction; Wound healing; Protein tyro sine kinase; IFN-γ
参与伤口修复的细胞通过自分泌和/或旁分泌多种生物活性物质如生长因子等调节自身或其 它细胞的增殖、分化、凋亡、移动和合成多种物质如各种因子和细胞外基质等功能，共同完 成伤口的修复过程。多种生长因子在修复的早期刺激细胞增殖和物质合成，后期还调节细胞 的凋亡、移出和释放分解胶原等细胞外基质的酶类，参与瘢痕组织的改建和塑形等瘢痕成熟 过程。已经证实，生长因子家族的刺激信号经其受体PTK［1］活化转递。而IFN- γ刺激信号经JAKs-STATs(Janus Kinase-Signal Transducer and Activator of Transcrip tion)传导［2～3］，JAKs也具有酪氨酸激酶活性。创伤愈合期IFN-γ对伤口周 边组织和肉芽组织中PTK活性的影响未见报告，我们进行了检测。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 leupeptin、aprotanin、AEB SF和氟化钠购自sigma公司；(γ-32p)ATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司； 重组兔IFN-γ和PTK检测kit购自Promega公司；蛋白质定量试剂购自Bio-RAD公司；Beckman GS-15R冷冻高速离心机；Polytron超声匀浆仪；Beckman LS 6500液闪仪；Perkin Elmer Lambda 14紫外可见光分光光度计等。
1.2 创面形成和用药方法 健康家兔（体重2.0～2 .5kg）5只，雌雄不限。3%戊巴比妥钠1.5～1.8ml静脉注射麻醉，耳腹侧做1.0cm×1.0cm大 小创面，间隔1.0cm，深度达耳软骨膜，左右各6处，共60个创面。处理侧每日用IFN-γ溶液 （1000 U/ml）换药，对照侧使用生理盐水，直到伤口愈合。伤后1天、3天、6天、12～16 天(上皮化时)收集创面肉芽组织（伤后1天时肉芽组织很少，不取材）和创周3mm 内组织（ 深度与创伤一致），迅速置液氮中冻存。
1.3 PTK活性测定 按kit的说明进行。简而言之，按1∶10（W/V）比例加入样品缓冲液于组织中，匀浆 。14000g离心5min，留上清液作为酶样，按每一反应含0.5mM ATP 1μl、γ-32pAT P(3000ci/m mol) 0.05μl和去离子水1.45μl，准备ATP混合物。以上操作均在0～4℃进 行。
反应总体积为25μl。每次反应加PTK测定5x缓冲液5μl、PTK多肽底物12.5μl、1mM 矾酸钠2.5μl、100mM DTT 2.5μl、γ-32pATP混合物2.5μl和去离子水5μl，空白 反应用PTK稀释缓冲液代替酶样，混匀。30℃温育5min, 加酶样5μl启动反应，准确30℃温 育15min（温育时间、酶样要否稀释和PTK底物选择均由预实验确定），加12.5μl终止缓冲 液终止反应。每样品均为双复管。点反应混合液12.5μl到SAM2TM膜。依次用2M NaCl 、含1%磷酸的2M NaCl和去离水洗膜，总时间约12～15min；另外，任取两个反应液各5μl点 到SAM2TM膜但不洗，所有膜均在室温干燥，液闪计数膜的放射活度。
按Bio-RAD公司的去污剂蛋白质含量法测定总蛋白质含量，除对照组外，样品用血液分析仪 测定血红蛋白含量，总蛋白质含量减去血红蛋白含量即为组织蛋白含量(如公式)。
计算公式：
cpm无酶样的计数平均值为920.47。γ-32pATP的特异 活性=（37.5/5）x/2500=2202.933cpm/p mol(x为未洗膜的平均每分钟计数值)，本次实 验测得146862.20。
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