张永刚 卢世璧 王继芳 张伯勋
【摘要】 目的 通过观察骨形态形成蛋白(BMP-2)、β型转化生长因子(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(bFGF)在引导性骨再生中的表达，探讨引导性骨再生的机制。 方法 成年雄性新西兰兔42只，随机分为6组，每组7只，在其双侧桡骨中段制作10 mm标准骨缺损不愈合模型，随机选择一侧为实验侧，用硅胶膜成管状包裹骨缺损，另一侧为对照侧。术后3天和1、2、3、4、5周处死取材，进行组织学以及BMP-2、TGF-β、bFGF 单克隆抗体的免疫组化染色和cDNA探针原位杂交观察。 结果 （1）组织学观察：骨缺损处形成密闭腔室，隔膜管内骨折端细胞增殖形成肉芽组织，提供成骨细胞来源。（2）实验侧和对照侧3天时血肿中炎性细胞时即开始表达bFGF，增殖骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞表达TGF-β。1周时骨端骨细胞、骨痂成骨细胞才开始表达BMP-2，同时也表达TGF-β。肉芽组织形成后，其单核巨细胞、多核巨噬细胞、间质细胞均表达TGF-β、bFGF。（3）3种生长因子在实验侧和对照侧的含量有明显差别。实验侧总体含量明显高于对照侧(P<0.01)，各个时间组实验侧含量也高于对照侧。 结论 引导性骨再生成功的关键是由于隔膜在骨折局部形成了一个相对独立的骨再生环境，排除了周围组织的干扰，能够防止生长因子扩散，使骨缺损局部的生长因子含量相对增加，最终成功地诱导骨再生修复骨缺损。
【关键词】 骨再生 生长物质
Expression of BMP-2, TGF-β, bFGF in guided bone regeneration
ZHANG Yonggang,LU Shibi,WANG Jifang,et al.
Department of Orthopedics,General Hospital of Chinese People′s Liberation Army,Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To study the mechanism of guided bone regeneration combined with osteoinduction by observation of expression of BMP-2, TGF-β, bFGF. Methods 42 adult, male, New Zealand rabbits were randomly divided into 6 groups,each group being 7 rabbits.10mm standard bone defect model was produced bilaterally in the middle radial shaft of each rabbit. Randomly, one defect enveloped with silicon membrane was tested, and the other served as control, sacrificed at 3 days, 1,2,3,4,5 weeks after surgery for histological observation, immunohistochemical staining of BMP-2, TGF-β, bFGF and in situ hybridization of their cDNA probes. Results Histologically bone defects was sealed by silicon membrane, in which inflammation tissue and callus were formed from cells in bone ends. Similar expression of BMP-2, TGF-β,bFGF between the test groups and control groups was noted. Inflammatory cells in the hematoma expressed bFGF and proliferating periosteal cells, endosteal cells, medullary mesenchymal cells expressed TGF-β at 3 days postoperatively. Osteocytes in the bone ends and osteoblasts lining callus surface started to express BMP-2, TGF-β at first week after surgery. Following the formation of inflammation tissue, in which giant cells, macrophages, mesenchymal cells expressed TGF-β, bFGF respectively. Although the expression of three osteoinductors was the same between the test and control sides, their content was very different in both sides. The whole content in all test sides was much more than all control sides (P<0.01), the content of test side was also much more than control side in each group. Conclusions It is a key reason for successful guided bone regeneration that membrane tube formed a relatively independent bone regenerative situation to prevent around tissue from interruption, and to prevent osteoinductors from diffusion, so that enhanced osteoinductors induced bone regeneration to repair bone defects.
【Key words】 Bone regeneration Growth substances
引导性骨再生是研究骨折修复新的手段。既往的研究已证实，应用引导性骨再生技术能够修复大段动物长管骨缺损［1］，但其机制尚不清楚。我们结合骨诱导理论，通过观察骨形态形成蛋白(BMP-2)、β型转化生长因子(TGF-β)及成纤维细胞生长因子(bFGF)在引导性骨再生中的表达，旨在探讨生长因子在引导性骨再生中的作用，进而完善和丰富引导性骨再生机制的理论。
材料与方法
1．模型与分组：42只成年雄性新西兰兔，体重2.0～3.0 kg，随机分为6组，每组7只；随机选择一侧桡骨为实验侧，另一侧做对照。常规手术方法，连同骨膜截除桡骨中段10 mm，实验侧用硅胶隔膜包裹骨缺损，制作引导性骨再生模型，对照侧骨缺损不做特殊处理，待其自然修复。由于成年新西兰兔远近侧尺桡关节已骨性连接，所以骨缺损模型无需特殊固定。分别于术后3天和1、2、3、4、5周处死，将骨缺损处组织连同骨端一同取材。
2．主要试剂：BMP-2单克隆抗体（第四军医大学），TGF-β、bFGF 单克隆抗体（Sigma 公司），BMP-2、TGF-β、bFGF cDNA探针（军事医学科学院）。
3．观察方法：取材后标本以4％多聚甲醛固定24小时，20％EDTA脱钙1～3周，石蜡切片(厚7 μm)，分别进行常规HE染色、SP方法单克隆抗体的免疫组化染色。BMP-2抗体和TGF-β抗体工作浓度均为1∶300，bFGF抗体工作浓度1∶500。DAB方法显色，阳性为棕色，对照以PBS代替Ⅰ抗。常规地高辛标记cDNA探针原位杂交：BMP-2 cDNA探针工作质量浓度500 ng/ml，TGF-β cDNA探针工作质量浓度500 ng/ml，bFGF cDNA探针工作质量浓度500 ng/ml ，NBT方法显色，阳性为蓝色，对照用试剂盒中非相关探针替代特异探针。
4．生长因子定量分析：40×40视野下，每张切片随机取10个视野，利用TIPAS/88型真彩色医学通用图像分析仪（解放军总医院肾病中心），测量骨缺损内纤维肉芽组织中上述3种生长因子免疫组化显色的平均灰度，采用t检验方法进行统计学处理。
结 果
1．组织学观察：实验侧术后3天骨内膜、骨髓基质以及隔膜下的骨膜增生活跃，隔膜管内空间为血肿占据。1周时骨折断端处骨髓腔内生成编织骨痂，同时增殖细胞向血肿内生长。2周时血肿完全机化，形成肉芽组织，其中有大量间质细胞。5周时缺损内间质细胞仍然保持增殖活跃状态，胞体大，核大淡染，同时在两骨端处仍有骨痂产生。实验侧成骨过程无软骨出现，为膜内成骨过程。
对照侧1周时骨端骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞以及由肌肉组织增殖而来的肉芽组织夹带肌纤维向骨缺损内生长，接近骨端处可见软骨形成。2～3周时有明显的软骨内成骨。4周后已形成的软骨开始萎缩、退变，肉芽组织变为成熟纤维组织，胞体变小，核小深染。对照侧成骨过程为软骨内成骨。
2．免疫组化观察：（1）实验侧：3天时血肿以及血肿中炎性细胞bFGF呈阳性染色，增殖的骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞TGF-β阳性染色(图1)，BMP染色阴性。1周时骨端骨细胞、编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞呈TGF-β染色阳染色(图2),骨端骨细胞、骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞BMP-2染色阳性；1～4周时肉芽中的单核巨细胞、多核巨噬细胞以及间质细胞呈bFGF 阳性染色，4周后阳性细胞减少。2～4周时新生成的编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞、肉芽中的间质细胞、单核巨细胞、多核巨细胞TGF-β染色阳性。4周以后肉芽组织中TGF-β阳性细胞明显减少，编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞仍呈TGF-β染色阳性(图3)。2～5周时骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞仍呈BMP-2阳性染色。（2）对照侧：阳性染色细胞同实验侧在细胞种类和染色时间上相同，不同的是对照侧1～4周内软骨细胞也呈TGF-β、BMP-2阳性染色。
图1实验侧术后3天时,骨端骨内膜细胞、骨髓间质细胞表达TGF-βSP方法×20
图2实验侧术后1周时骨端骨细胞表达BMP、TGF-β,SP方法×40
图3实验侧伴随骨痂生长,骨痂骨细胞、表面成骨细胞始终表达TGF-βa SP方法×40
3．原位杂交观察：（1）实验侧：术后3天时血肿中炎性细胞bFGF mRNA呈阳性表达,增殖的骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞TGF-β mRNA也呈阳性表达,但增殖的骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞均不表达BMP-2。1周时骨端骨细胞、 编织骨痂骨细胞、 骨痂表面成骨细胞呈TGF-β mRNA表达,骨端增殖细胞、骨端骨细胞、骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞BMP-2 mRNA表达。1～4周时肉芽中的单核巨细胞、多核巨噬细胞以及间质细胞呈FGF mRNA表达。4周后阳性表达细胞减少。2～4周时新生成的编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞、肉芽中的间质细胞、单核巨细胞、多核巨细胞TGF-β mRNA表达，4周以后肉芽组织中TGF-β阳性表达细胞明显减少，编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞仍呈TGF-β mRNA表达。2～5周时骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞仍呈BMP-2 mRNA表达。（2）对照侧：除上述阳性表达细胞外，软骨细胞也呈TGF-β、BMP-2 mRNA表达。
4．图像分析：每只动物各随机选取5张切片，每组实验侧与对照侧各35张切片，进行组内实验侧与对照侧灰度测量；所有实验侧与对照侧各共210张切片进行实验侧与对照侧总体灰度测量。结果总体实验侧3种因子的含量均明显高于对照侧（P＜0.01）（表1）。
表1 bFGF、TGF-β、BMP-2实验侧与对照侧
总体含量比较(灰度值，±s)
组 别 bFGF TGF-β BMP-2
实验侧 125.16±3.08
135.86±6.32
140.57±6.52
对照侧 119.92±2.69? 126.27±4.81? 127.25±4.28?
注：?与实验侧比较，P＜0.01
讨 论
引导性骨再生能够修复大段动物长管骨缺损，结果令人鼓舞［1,2］， 但其机制尚不清楚。Nyman［3］在提出这一概念时，其基本观点就是通过隔膜的物理屏障作用，有目的地选择所需组织长入，排除不利组织的干扰，最终使损伤的组织得以修复。但是Minabe［4］在研究了牙周组织的修复过程后，对隔膜单纯物理阻挡作用的观点提出了质疑。骨折生物学研究也表明，骨再生的实质就是骨原细胞(osteogenic cells)的募集、增殖和分化变为软骨细胞、成骨细胞，继之成熟的软骨细胞、 成骨细胞分泌骨基质、矿化的两个过程，其中任何一个环节的异常，都将阻断正常的骨再生过程；骨原细胞至少有3个来源：骨膜（包括骨内膜）、骨髓以及周围肌肉的间质组织。而且骨折周围肌肉间质组织中伴随血管长入的骨原细胞，对形成桥接骨痂有着重要的作用［5］。从组织来源这一点分析，引导性骨再生恰恰将周围骨原细胞隔离于骨缺损外，由于再生组织的来源减少，其再生的能力应当减弱，引导性骨再生更难修复骨缺损。但是，引导性骨再生成功的事实，提示我们应当从更深角度去认识引导性骨再生。Niederman［6］提出，加深对这一再生现象的理解，根本在于进一步认识在这一组织再生过程中，组织、细胞复杂的生物学调节机制，包括大量的细胞因子所发挥的作用等。早在60年代末Urist就提出了骨诱导理论［7］，此后人们对骨再生中的生长因子进行了大量研究，目前已证实生长因子是决定骨组织发生的决定性因素，借助当代骨诱导理论，有助于从分子水平进一步认识引导性骨再生的实质。
bFGF是分裂素，与各种细胞的增殖、细胞迁移、血管形成有关，与间质细胞、成纤维细胞的活化和功能状态有关；TGF-β与间质细胞、成纤维细胞、前成骨细胞以及成骨细胞的功能状态有关，在骨折修复中发挥重要作用；BMP 是唯一能够诱导异位成骨的因子，无论在原位还是在异位，BMP都将发挥决定性作用，没有BMP的存在就不能成骨［8］。本实验有目的地选择了这3种有代表性的生长因子， 观察其在引导性骨再生中的表达时间、表达细胞以及分布规律，从而进一步探讨引导性骨再生成功的机制。
在实验中我们发现，bFGF早期分布于骨端及血肿中，肉芽形成后，主要分布在肉芽组织中间质细胞之间。从这种表达时间和分布形式来看，我们认为bFGF早期的作用是使骨端各种细胞分裂、增殖，从而使血肿机化，形成肉芽组织，其后主要作用是使间质细胞或成纤维细胞保持增殖活跃状态，因为肉芽组织中呈活跃状态的间质细胞周围并无bFGF的分布。BMP-2分布于肉芽组织中，与间质细胞向成骨细胞系分化有关，这样才能使骨痂不断产生。由于3天时并无BMP-2的表达，因此早期TGF- β的表达可能与刺激骨端成骨细胞表达BMP-2有关，待肉芽组织形成后，TGF- β均匀分布于软组织中，辅助BMP-2促成间质细胞适时地分化为前成骨细胞，继之后者又适时地转化、成熟为成骨细胞。
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