郭昭庆 党耕町 王志国 张惠珠
【摘要】 目的 观察骨髓基质细胞在多孔状的人工骨块上三维立体培养后的生长情况及其复合植入体内后的成骨能力。 方法 利用组织工程学方法，将骨髓基质细胞种植于羟基磷灰石人工骨块上，立体培养2周，用扫描电镜观察细胞在体外的生长情况；将上述细胞人工骨复合体自体异位植入体内，取材观察其植入体内后的成骨情况。 结果 细胞在人工骨块上能立体培养成活，细胞多生长于周边的孔隙表面，尤其以贴近培养瓶底的那一边较多，骨块的中心部位未见细胞生长。自体异位植入后4周，大多数的人工骨中可见新骨形成，新形成的骨多紧贴于人工骨的表面，并可见活性的成骨细胞、骨样组织及类似于正常骨组织中骨髓腔样的腔隙组织。 结论 骨髓基质细胞可用作骨组织工程学的种子细胞，多孔状的羟基磷灰石是可利用的细胞载体。
【关键词】 骨髓 细胞外基质 骨 生物医学工程
Bone tissue engineering seeded with bone marrow stromal cells
GUO Zhaoqing,DANG Gengting,WANG Zhiguo,et al.
Department of Orthopaedics,Third Teaching Hospital, Beijing Medical University,Beijing 100083.
【Abstract】 Objective To assess the ability of bone graft substitutes to support the growth of cells in vitro and new bone formation in vivo. Methods The methods of tissue engineering were employed,the bone marrow derived stromal cells were seeded onto blocks of hydroxypatite(HA), cultured for two weeks,and implanted intermuscularly into the rabbit back muscle,scanning electron microscopy and undecalcified bone tissue sections were used to evaluate the the growth of cells in vitro and new bone formation in vivo. Results The stromal cells were attached to and grew upon the surface of the periphery HA pores, ecpecially in the pores adjacent to the bottom of culture flasks. No cell growth was found on the surface of the central pores. At four weeks after implantation, new bone formation was observed in most HA blocks, almost all of the new bones were lamellar bone and deposited directly on the surface of the HA pore. Active osteoblast and osteoid were found on the surface of the newly formed bone, invasion of bone marrow was observed in some newly formed bone. Conclusion Bone marrow stromal cells are patentially the source of seeded cells for use in bone tissue engineering, and the HA may be considered as a suitable scaffold for these cells. The findings may be useful for detailed reseraches on seeded cells,scaffold and implanting fashion of bone tissue engineering.
【Key words】 Bone marrow Extracellular matrix Bone Biomedical engineering
组织工程学是近20年来随着细胞生物学及生物材料学技术的发展而出现的一门边缘学科，它是应用生物学和工程学的原理，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门学科，方法是将体外培养的高浓度的活细胞种植于天然的或人工合成的细胞外基质载体上，然后将它们移植到体内，达到形成新的有功能的组织的目的［1］。Kazuhito等［2］利用此方法，将软骨细胞种植于羟基磷灰石人工骨上培养，然后植入体内桥接骨缺损获得成功。Vacanti等［1］将外膜来源的成骨细胞种植于生物降解聚合物上培养后植入，6周后半数以上的移植物中有新骨形成。Begley等［3］的研究表明，松质骨组织来源的成骨细胞，也能在多孔状的羟基磷灰石人工骨块上培养成活。骨髓细胞由于其具有成骨潜能，且具有取材方便、对供体部位损伤小等优点，近年来倍受重视。本研究旨在将骨髓基质细胞种植于人工骨块上，进行立体培养，观察细胞在体外的生长及其植入体内后的成骨情况。
材料与方法
1．主要试剂及设备：DMEM培养液（gibco），小牛血清（北京奶牛厂产品），胰蛋白酶（promega），羟基磷灰石人工骨(HA，清华大学精细陶瓷实验室产品，孔径100 μm～300 μm，孔隙率50%)，扫描电镜（日立S-450）。
2．骨髓基质细胞的原代培养：取4周龄的新西兰白兔6只，体重约2.5 kg，雌雄不限，戊巴比妥（30 mg／kg）麻醉后，无菌条件下自左侧髂嵴部用20号骨穿刺针抽取每只动物的骨髓1.5 ml。用含肝素的DMEM培养液稀释成细胞悬液（混合细胞悬液，含造血系细胞及基质细胞）。
将骨髓细胞悬液以每瓶1×108个的密度，分别接种于75 ml培养瓶中，置37℃，5%CO2条件下培养，1周后第一次全量换液，换液时轻轻摇晃培养瓶，使沉于瓶底的造血细胞随换液去除。此后视情况每2～3天全量换液一次。当原代细胞融合形成单层后，用0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化细胞并计数。
3．骨髓基质细胞的立体培养及其生长情况的观察：将羟基磷灰石人工骨切成5 mm×5 mm×5 mm的骨块,用三蒸水在超声清洗机上反复清洗，洗净其表面及孔隙中的碎屑，干燥后高温高压灭菌备用。将上述原代培养后消化下来的骨髓基质细胞悬液，以每块1×106个的密度接种于人工骨块上，每只动物的细胞接种3块人工骨，在等同于原代培养的条件下培养。2周后，取每只动物的细胞培养的人工骨块各1块共6块，用D-Hank?s液把表面及孔隙内轻轻冲洗干净，制作扫描电镜标本。用扫描电镜观察细胞在人工骨块的表面及孔隙内的生长情况。
4．成骨能力的观察：将种植骨髓基质细胞培养2周后的骨块植入自体右侧背肌中，每只动物植入2块，左侧背肌中植入2块相当大小的不含细胞的单纯人工骨块作对照。4周后处死动物取材，将连带周围部分肌肉的人工骨块标本置于Million′s液中固定，酒精上行脱水，二甲苯透明，甲基丙烯酸甲酯浸透及包埋，用Reichart自动切片机切取5 μm的不脱钙骨切片，甲苯胺兰或HE染色后光镜下观察。
结 果
1．骨髓基质细胞原代及立体培养：骨髓细胞悬液接种后，培养物中造血系细胞随着换液逐渐被去除。接种后24小时，可见瓶中有少量细胞贴壁，初期的贴壁细胞多为不规则形或短梭形，之后可见贴壁细胞渐分裂增殖，形态也渐变为长梭形，约2周左右，贴壁生长的细胞即可融合形成单层。这与多数学者描述的骨髓基质细胞原代培养的生长特征一致［4，5］。
将骨髓基质细胞种植于人工骨块上立体培养2周后，6块人工骨中均有细胞生长。但并非所有的孔隙表面均有细胞生长。细胞多生长在位于周边的孔表面，尤其以贴近培养瓶底的那一边较多，骨块的中心部位未见明显的细胞生长。细胞匍附于人工骨的孔表面上，将孔表面的小凹陷盖住。细胞大多呈多角形，胞突较多，少数为梭形（图1～4）。
图1骨髓基质细胞在人工骨上立体培养2周扫描电镜观察:
细胞(C)附于人工骨的孔表面上,将孔表面的小凹盖住
图2骨髓基质细胞在人工骨中生长的情况:细胞大多呈多角形
图3骨髓基质细胞在人工骨中生长的情况:可见较多的胞突
图4未种植细胞的人工骨扫描电镜观察:人工骨的孔隙表面可见许多小凹陷(X),未见细胞生长
2．成骨能力的观察：立体培养的骨髓基质细胞自体异位植入后4周，6只动物的12块人工骨块中，4块因切片过程中羟基磷灰石碎裂成粉状而无法观察，剩下的8块中，有6块人工骨中可见新骨形成。新形成的骨大多紧贴于人工骨的表面（图5）。多为成熟的板层骨。在朝向孔隙的新骨表面上，可见立方状的排列整齐的活性成骨细胞，其下可见较厚的未钙化骨样组织层（图6）。在某些新形成的板层骨中，尚可见类似于正常骨组织中骨髓腔样的腔隙组织（图7）。此外，在另外的有些表面上，虽然尚未见明显的新骨形成，但其表面的细胞明显地更大且着色更深，细胞排列的形状类似于上述新形成的骨的形状（图8）。除上述有新骨形成及有增大的细胞两种表面外，剩余的人工骨的其它表面则被长梭形或小颗粒状细胞所占据（图8）。
图5种植细胞的人工骨新骨形成的情况:新形成的骨(B)多紧贴于人工骨(H)的孔隙表面HE×400
图6种植细胞的人工骨中新骨形成:新形成的骨多为板层骨(L),
在其表面可见活性成骨细胞(A)及骨样组HE×400
图7种植细胞的人工骨中新骨形成:新形成的骨中可见骨髓腔样腔隙(M)HE×400
图8种植细胞的人工骨中细胞肥大及深染情况:图中箭头所示为肥大及深染的细胞HE×100
而单纯人工骨异位移植4周后，在切成片的所有5块人工骨中，均未见有新骨形成，也未见有细胞的肥大及浓染。表面均为长梭形的类似于纤维组织样的结构（图9）。
图9未种植细胞的人工骨植入后的情况:未见新骨形成,孔隙表面多为纤维样组织HE×100
讨 论
一、骨组织工程学中的种子细胞(seeded cell)
骨的组织工程学要求被种植的种子细胞必须是有成骨潜能的细胞。目前已分别有研究利用骨外膜成骨细胞（osteoblast）［1］、松质骨组织来源的成骨细胞［3］及软骨细胞［2］作为骨组织工程学的种子细胞。而将骨髓基质细胞用作种子细胞的研究报道很少。与上述种子细胞相比，骨髓基质细胞具有取材方便、对供体部位损伤小等优点，临床应用前景更广阔。
本研究的结果表明，将骨髓基质细胞种植于多孔状的羟基磷灰石块上，能在体外培养成活，将这种细胞与载体的复合物异位植入体内后，部分表面能直接成骨，而且是板层骨，新形成的骨表面仍可见活性的成骨细胞，未见软骨形成，而同期植入的不带细胞的单纯人工骨表面则未见新骨形成，说明既不是软骨内化骨，也非受区的间充质细胞分化成骨，而可能为骨髓基质中含有的具有成骨潜能的定向型骨祖细胞（determined osteogenic precursor cells）直接分化为成骨细胞并成骨。
此外，尚有一部分表面的细胞肥大、浓染，有成骨的雏形，虽然本研究未能对其细胞的性质进行鉴定，对其是否能最后成骨也尚待研究，但推测可能是骨髓基质中的诱导型骨祖细胞（inducible osteogenic precursor cells），在种植异位植入后，被受区一些细胞因子诱导，正在向成骨细胞方向分化，只是由于取材时间尚早，因此在这些区域尚未能见到成熟的新骨形成。
本研究还发现， HA块的孔隙表面上有一部分被梭形的纤维样组织覆盖，这可能与种子细胞不纯有一定的关系。目前已有学者试图通过克隆培养［6］、免疫细胞化学［7］及基因逆转录等方法［8］纯化成骨潜能细胞，以期提高细胞复合植入后的成骨量及成骨速度。但正常骨组织表面本身就含有多种细胞，将单一细胞分离提纯后移植，是否会因失去了正常的细胞间作用反而降低其移植后的成骨，这些问题还有待于进一步研究。
二、载体的选择
目前一般认为［3］，网眼状的羟基磷灰石因其具有与正常骨组织相似的多孔结构及成份，具备宽大的内部空间和表面积，能容纳较多量的细胞，尚有生物化学槽的功能，因此就其骨传导性能来讲，较适合用作骨组织工程中的种子细胞载体。但理想的细胞载体还需有良好的生物降解性能，羟基磷灰石因降解较慢［9］，限制了其在临床上的广泛应用。现已发现羟基磷灰石（HA）与磷酸三钙（TCP）的复合物既保存了单纯HA的优点，又可根据需要，通过调整两者的复合比例控制其植入后的降解速度［2，10］，因此HA+TCP被认为是目前最理想且有较大的临床应用前景的、骨组织工程学的细胞载体。本研究由于尚属体外及动物实验的初步研究，未对HA的生物降解性作进一步探讨。
一般认为，孔径 500 μm左右的人工骨最适合细胞的生长及血管的长入［11］。本研究所用人工骨的孔径范围为100～300 μm，但结果发现，并非所有的孔隙表面均有细胞生长，而只在靠近块表面的孔隙中有细胞生长，块的中心部位基本无细胞，这是否与孔径过小而使营养及气体交换不畅有关还尚待研究。此外，如何使细胞在人工骨块上均匀贴壁也是值得进一步探讨的问题。尚需找寻适于细胞生长及移植的最佳块径。
三、移植方式的选择
迄今已有许多骨髓细胞复合人工骨移植的实验研究及临床应用报道［12，13］，但大多仅是将人工骨浸入骨髓细胞悬液后直接植入，这种移植方式带有很大的缺陷。首先，骨髓中有成骨潜能的细胞仅存于基质中，且数量很少，尽管复合植入的细胞可能很多，但大多为造血系细胞；其次，由于骨髓本身的液体性质，如果将其直接吸附于人工骨中植入，成骨潜能细胞可能因受区出血及吸引等原因被冲走，使其数量进一步减少；再者，不管是定向型还是诱导型骨祖细胞，植入后都需要在体内经过一定的时间后，才能分化为成骨细胞并成骨。这些因素显然对移植物的骨掺入量及融合速度有影响，导致目前的复合人工骨植入后融合速度慢，对移植后是否融合带有很大的不可预知性，从而限制了它在临床的广泛应用。
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