陈建庭 李菊根 金大地
【摘要】 目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对成骨细胞DNA合成和细胞周期变化的影响及其在骨折修复中的作用。 方法 从胎鼠颅骨分离、培养成骨细胞，应用流式细胞仪观察PDGF对成骨细胞DNA合成及细胞周期的影响；通过透射电镜观察细胞的超微结构改变，了解PDGF在鼠成骨细胞分泌功能方面的作用。 结果 (1)PDGF对培养24小时的成骨细胞S期的DNA含量明显增高(17.7%)；(2)PDGF促使细胞内线粒体更丰富，粗面内质网增多。 结论 PDGF可通过刺激成骨细胞的DNA合成，促进成骨细胞的分裂、增殖及细胞的合成分泌。
【关键词】 血小板源生长因子 成骨细胞 DNA 流式细胞术
The effects of platelet-derived growth factor on rat osteoblastic DNA contents
CHEN Jianting*,LI Jugen,JIN Dadi.*
Department of Orthopaedics, Nanfang Hospital, First Military Medical University，Guangzhou 510515．
【Abstract】 Objective To study the effects of platelet-derived growth factor (PDGF) on the DNA content of the isolated osteoblast-like cells and the cellular period changes, and further study the effect of PDGF on bone fracture healing. Methods The cultured osteoblast-like cells in vitro were isolated from fetal rat calvaria and the effects of PDGF on cellular DNA contents were observed under flow cytometer. The changes of osteoblastic surface structure and ultrastructure were observed under electron microscope. Results PDGF could increase the DNA contents of cellular S period by promoting osteoblast from G0/G1 period into S period. The effects of PDGF on increasing cellular DNA contents were most significant at 24th culture hour (DNA content: 17.6% at the 24th hour, 9.0% at the 48th hour, 10.2% at the 72nd hour).PDGF could increase osteoblastic surface granules, reticular fibers and intracellular calcium salt crystals, and calcium granule mitochondria. Conclusions PDGF could promote bone fracture healing by stimulating osteoblastic DNA synthesis and cell proliferation. The flow cytometer is a better instrument to analyze cell DNA content for a large number of cells.
【Key words】 Platelet derived Growth factor Osteoblasts DNA Flow cytometry
成骨细胞分泌骨基质(胶原和糖蛋白)，并参与骨基质及骨钙的代谢，是骨形成过程中的主要功能细胞［1］。生长因子与骨细胞的分裂、增殖、骨折愈合密切相关［2］。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)是一种存在于多种组织中的促细胞有丝分裂的多肽生长因子，能刺激多种细胞如成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等分裂、增殖［3］，但其在组织中的含量极低。我们采用细胞培养技术，从SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞，加入重组人PDGF，应用流式细胞仪(FCM)定期测量成骨细胞内各周期DNA含量，并以透射电镜观察细胞的超微结构改变，旨在了解PDGF在鼠成骨细胞分泌功能方面的作用。
材料与方法
1.细胞分离、培养：采用酶消化分段收集法［4］，取出生1～2天的SD大鼠颅盖骨，剔除其内外表面的结缔组织，经Hepes缓冲液冲洗、剪碎，0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(Sigma公司)反复消化4次，弃去第1次消化液，过滤收集后3次消化液；将过滤液离心(1?000 r/min，15分钟),使细胞沉淀，沉淀物中加入Hepes缓冲液冲洗、打匀，制成细胞悬液；将细胞悬液分装种植于25 ml的培养瓶内，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞生长成致密的单层时，按1∶2的比例进行传代培养。
2.实验分组：以DMEM(Gibeo公司)培养液培养的细胞为对照组；以加入PDGF(Promega公司)100 ng/ml的DMEM条件培养液培养的细胞为实验组。
3．FCM观察细胞DNA周期变化［5］：FCM样本的制作步骤为：原代细胞生长5～7天后按1∶2传代培养，第一代传代以细胞数1×105个/瓶接种于50 ml培养瓶，对照组加DMEM培养液,实验组加入含PDGF的DMEM条件培养液，分别培养24、48、72小时。每24小时以0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，移入离心管，以1?000 r/min离心5～10分钟，PBS缓冲液冲洗，离心2次；400目筛网过滤，制备单细胞悬液，移入离心管；每管单细胞悬液中加入1 ml已预冷的70%乙醇，4 ℃冰箱固定30分钟，去除固定液，PBS冲洗，离心，加入DNA荧光探针碘化丙啶(PI)和 RNA酶(RNase)混合染色液1 ml，摇匀，4 ℃冰箱避光染色30分钟；以健康人淋巴细胞DNA含量为标准值。对照组和实验组分别测8个样本，每个样本测5?000～10?000个细胞。
4．透射电镜观察：3天后将培养瓶内细胞用缓冲液冲洗、消化后，置入琼脂离心管内，离心收集成骨细胞。将琼脂模块取出，经2.5%戊二醛固定、锇酸后固定、丙酮逐级脱水、树酯浸透包埋后，超薄切片，铜、铀双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察细胞超微结构改变。
结果
1．24小时细胞周期：DNA含量各时相值：流式细胞仪检测培养24小时的鼠成骨细胞DNA含量。处于G0/G1期细胞的DNA含量:对照组为(77.7±6.4)%;实验组为(71.8±2.8)%;S期的细胞DNA含量:对照组为(9.5±2.3)%;实验组：(17.6±3.3)%，实验组细胞此期的DNA含量显著高于对照组(P＜0.01)。处于G2期的细胞DNA含量:对照组为12.8%;实验组为10.6%。
2．PDGF对不同时间点细胞周期DNA含量的影响(表1)：实验组与对照组比较，24、48、72小时不同时间点细胞G0/G1期DNA含量均减少，S期DNA含量明显增高(P<0.01)。加入PDGF培养24小时的成骨细胞S期DNA含量明显增加(17.6%)，培养48小时和72小时的细胞DNA含量减少（分别为12.3%和10.2%)，但与对照组比较仍高(P＜0.05)。PDGF对成骨细胞的增殖作用以24小时组最明显，表明PDGF对成骨细胞早期增殖作用更显著。
3．透射电镜观察：对照组胞浆丰富，各细胞器较成熟，粗面内质网和高尔基体较多，胞浆及线粒体内、嵴上有散在电子密度高的颗粒即磷酸钙颗粒（图1）。实验组分泌期细胞增多，胞浆及线粒体内钙颗粒明显增多，均质性分泌小泡也增多（图2）。另可见一些大的囊泡，内含一定密度的无定形物质，这是一些细胞代谢活跃分泌的物质,相当于光镜下所显示的PAS阳性反应颗粒。
图1透射电镜示对照组鼠成骨细胞内线粒体、粗面内质网及散在
的电子密度高的颗粒即鳞酸钙颗粒
图2透射电镜示:实验组鼠成骨细胞内线粒体较对照组丰富并且膨大形成空泡状,
均质中分泌小泡增多,胞浆内的钙颗粒增多
表1 PDGF对各组细胞周期DNA各时相
含量的影响(%，±s)
项 目 24小时 48小时 72小时
G0/G1期
对照组 77.4±6.4
92.3±8.4
87.7±5.3
实验组 71.8±3.7 88.1±5.6 81.1±8.4
S期
对照组 9.5±2.3 6.2±1.0 7.7±1.8
实验组 17.6±3.3?? 9.0±2.5? 10.2±2.2?
G2期
对照组 12.8±3.9 1.5±0.2 4.6±0.9
实验组 10.6±3.6 2.3±0.5 8.7±1.2
注：与对照组相比，?P＜0.05,??P＜0.01
讨 论
流式细胞仪(FCM)是70年代后期发展起来的一种自动细胞分析技术。在医学研究领域，FCM用来测量细胞的成分或功能。其基本测试原理是通过细胞内某种成分特异性地（直接或间接）与荧光染料结合，然后测量其结合物的荧光值,根据所测荧光强度来反映这种成分的多少。FCM在研究大量细胞内的某种成分或功能方面具有显著优点，它集数据采集和图像信息处理于一体，对细胞内某种成分进行定量分析。FCM不仅能测细胞DNA含量，而且还可根据DNA分布，由计算机分析，得出细胞周期各时相的分布，提供有关细胞动力学信息。
本实验所采用的酶消化分段收集法可按实验要求而分离出所需的细胞量，大鼠颅盖骨剔除其内、外表面粘附的结缔组织仍可能残留一些非成骨细胞,经0.25％胰蛋白酶和0.1%胶原酶第一次消化后,骨块表层的细胞可被除去,后三次消化下来的细胞基本为骨块内的细胞，这样就可保证在同一实验中细胞的相对均一性，也保护了细胞膜表面的受体，因而能较客观、真实地反映PDGF的作用。
目前成骨作用的分泌理论认为：磷酸钙首先在细胞中沉积，然后被分泌、释放，转移到类骨质与骨质连接处的钙化区形成骨组织。本研究透射电镜观察显示，PDGF可促使细胞内线粒体更丰富，粗面内质网增多，胞浆及线粒体内的钙颗粒更多更大，说明成骨细胞的分泌功能大为增强。
成骨细胞的特异性受体可根据其存在的部位不同分为两类，即细胞膜受体和细胞内受体。细胞膜受体是细胞膜上的结构成分，一般为糖蛋白、脂蛋白或糖脂蛋白。PDGF主要通过成骨细胞膜上的特异性受体而发挥作用。
PDGF与细胞膜上的相应受体结合后，如何调节细胞的有丝分裂目前尚不完全清楚,可能通过以下几方面不同的信号传递途径促使有丝分裂信号向胞内传递，引起DNA的合成增加，细胞的分裂、增殖：(1)PDGF与其相应受体结合可活化膜内磷脂酶C，刺激脂醇磷脂产生三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯(DAG)［6］。IP3主要对内质网起作用，DAG则可激活蛋白激酶C(PKC)，使细胞内相关蛋白磷酸化或分解成乙酰甘油和花生烯酸。磷脂酶C的作用对刺激细胞从G0/G1期至S期极为重要。(2)通过内源性细胞内底物或细胞膜底物的自动磷酶化而调节酶的活性［7］。膜上受体酪氨酸激酶活化刺激受体上部分酪氨酸磷酸化。受体的自动磷酸化对细胞促有丝分裂十分重要。受体上自动磷酸化的酪氨酸残基一些底物作用的结合位点，如磷脂酶C-r,Ras的 GTP酶活化蛋白等，但是这些底物在促细胞分裂中的作用尚不清楚。(3)PDGF可通过调节其它细胞因子的产生和释放及其受体的活性而在细胞的增殖过程中与其它因子有协同作用。本实验FCM结果显示:PDGF可以增加成骨细胞S期DNA含量，而G0/G1期DAN含量相对减少,亦即说明PDGF对成骨细胞起作用，促进停滞于G0/G1期的细胞进入至S期，刺激成骨细胞的分裂、增殖。
总之，PDGF具有促进成骨细胞早期DNA合成，使成骨细胞从G0/G1期进入S期的作用；分泌期细胞增多，胞浆及线粒体内钙颗粒明显增多。PDGF是骨折修复中的重要生长因子。
本课题受国家自然科学基金资助
作者单位：510515 广州，第一军医大学南方医院骨科(陈建庭、金大地)；广州军区广州总医院骨科(李菊根)
参 考 文 献
1 van der Plas A,Nijweide PJ.Cell-cell interaction in the osteogenic compartment of bone.Bone,1988,9:107-111.
2 Joyce ME,Jingushi S,Scully SP,et al.Role of growth factors in fracture healing.Proc Clin Biol Res,1991,365:391-416.
3 Baylink DJ.Growth factors to stimulate bone formation.J Bone Miner Res.1993,8 Suppl 2:565-572.
4 李菊根，陈建庭，金大地.生长因子对成骨细胞钙离子浓度变化的动态观察.中华外科杂志，1999，37：34.
5 朱关珍，陆惠娟，王明雁，等.滋养细胞疾病DNA含量的流式细胞分析.上海医科大学学报，1995，22：275-278.
6 Kelly JD,Haldeman BA,Grant FJ,et al.PDGF stimulates PDGF receptor subunit dimerization and intersubunit trans-phosphorylation.J Biol Chem,1991,266:8987-8992.
7 Escobedo JA,Williams LT.A PDGF receptor domain essential for mitogenesis but not for many other response to PDGF.Nature,1988,335:85-87.
更多相关文档请点击>>血小板源生长因子(2)DNA(482)成骨细胞(3)流式细胞术(2) |
|
