杨镇 任大宏 李大鹏 裘法祖
【摘要】 目的 探讨肝硬化患者脾动脉壁的病理变化。 方法 以光镜、电镜、免疫组化法观察21例肝硬化患者和15例正常人脾动脉壁的病理变化和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric-oxide synthase, iNOS）的表达。 结果 与正常人对比，肝硬化患者脾动脉内膜增厚，内皮细胞不完整，内弹性膜变平并分裂和断裂，中膜平滑肌增厚，并迁移至内膜下，电镜下见平滑肌细胞变性、萎缩，有的肥大、增生和表型由收缩型向合成型转化。iNOS表达增强。管壁细胞外基质增多，致管壁胶原化和纤维化。 结论 肝硬化患者脾动脉可继发病理变化，使其收缩结构破坏和iNOS活性增强，这是导致血管对缩血管活性物质反应性下降的原因之一。
【关键词】 肝硬化 脾动脉 一氧化氮合酶
Portal hypertensive vasculopathy of splenic artery
YANG Zhen*,REN Dahong,LI Dapeng,et al.*
Department of Surgery, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030.
【Abstract】 Objective To study the pathological changes of splenic artery wall in portal hypertensive patients. Methods The pathological changes and iNOS activity of splenic artery wall were studied in 21 patients with liver cirrhosis and 15 normal sabiects, using light and electron microscope and immunohistochemistry. Results Compared with normal individuals,the splenic artery of cirrhotic patients showed that the intima was thickened,split and broken, and the smooth muscle layer of middle membrane was thicker and migrated to underintima space. In cirrhotic patients, regression,atrophy or hypertrophy and hyperplasia were seen in smooth muscle cells whose contractile phenotype changed to synthetic phenotype as well. iNOS activated obviously. Extracellular matrix increased in the wall,resulting in collagenic and fiberous changes. Conclusions Hemodynamic alteration due to liver cirrhosis induced pathological changes of splenic artery,including the damage to contractile structure and increase of iNOS activity.It is one of the reasons of decrease of artery reaction to contractile vasoactive materials.
【Key words】 Liver cirrhosis Splenic artery Nitric-oxide synthase
门静脉高压症可并发门静脉、胃冠状静脉和门体交通支血管结构与功能变化［1-3］。内脏动脉有无相应的继发性病理改变，迄今尚未深入研究。我们以脾动脉为观察血管，旨在探讨门静脉高压症所诱发的内脏动脉病变。
资料与方法
1．临床资料：1995年1月至1997年6月在本院外科住院治疗的21例肝硬化门静脉高压症患者，男14例，女7例，平均年龄42.6岁。纤维内窥镜检查见食管胃底静脉中或重度曲张。肝功能分级：Ⅰ级9例、Ⅱ级12例。均有1次或多次上消化道大出血史。术前均无高血压病史，血清甘油三酯、β脂蛋白及胆固醇均正常。均行脾切除加贲门周围血管离断术，术中取肝、脾组织作病理检查，证实为肝炎后肝硬变和瘀血性脾肿大。正常对照组为外伤性脾破裂患者，共15例，男10例，女5例，平均年龄37.8岁。均行单纯脾切除术。术后病理检查证实为正常脾脏外伤性破裂。
2．光镜检查：在脾门外游离出一段脾动脉，全周取材。以10％福尔马林液固定24小时，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。连续切片，厚4 μm。分别作HE、弹力纤维染色（Weigert法）和Masson三色染色。光镜下横、纵切面观察。
3．透射电镜样品制备及观察：每组各5例，将血管壁切成约1 mm3大小，常规固定、脱水、环氧树酯Epon 812包埋，切成超薄切片，铅铀双染。OPTON EM10C型透射电镜观察。
4．免疫组化染色和定量测定：采用S-P免疫组化法观察iNOS在脾动脉壁的表达分布。第一抗体为单克隆鼠抗人iNOS抗血清，由北京中山生物技术有限公司提供，工作浓度为1∶50。操作步骤按S-P试剂盒说明书进行，DAB染色，以胞浆内出现棕色颗粒为阳性染色。同时设空白对照（缓冲液PBS代替一抗）和替代对照（小牛血清白蛋白代替一抗），均为阴性。用同济医科大学产医用图像处理系统（TJTY-300），在40倍物镜下每张切片随机选取4个视野，计算其平均光密度值（OD）。
5．统计学分析：采用SAS软件统计包进行t检验，P＜0.05差异有显著性意义。
结果
肝硬化患者脾脏明显增大，脾静脉、胃冠状静脉 和胃周围的侧支血管曲张。肉眼观察，脾动脉壁比正常人明显增厚，硬度增加，弹性减弱。
1．光镜下观察：(1)HE和Masson三色染色：光镜下正常脾动脉壁分为内膜，中膜和外膜三层。内膜光滑，有完整的内皮细胞，内膜下无平滑肌细胞。中膜由多层平滑肌纤维组成，其间夹杂有胶原纤维和弹性纤维。外膜有滋养血管和周细胞（图1）。肝硬化患者脾动脉的内膜明显增厚，内皮细胞不完整，内膜下间隙出现空泡样改变，并见有平滑肌细胞和纤维结缔组织。中膜亦明显增厚，平滑肌纤维萎缩、变薄。胶原纤维和结缔组织成分增多，并将平滑肌细胞隔开，间距增大，肌纤维出现断裂（图2）。(2)Weigert弹性纤维染色：光镜下正常人脾动脉弹性纤维呈紫黑色，有内、外两层弹性膜。内弹性膜结构致密，呈波纹折叠（图3）。肝硬化患者的内弹性膜折叠的波纹变得平坦，或完全消失，并分裂成多层，有的完全断裂。弹性纤维排列紊乱并有断裂（图4）。
图1非肝硬变患者脾动脉。管壁分为内膜、中膜和外膜三层。内膜光滑，
有完整的内皮细胞，内弹性膜呈波纹状折叠，中膜由多层平滑肌纤维组成，
其间夹杂有胶原纤维和弹性纤维。 Masson三色染色×75
图2肝硬变患者脾动脉。内膜增厚，内皮细胞不完整，内膜下间隙出现空泡样改变，
并见有平滑肌细胞和纤维结缔组织。内弹性膜断裂。中膜增厚、平滑肌细胞排列紊乱，
细胞外基质成分增多，并将平滑肌细胞隔开，肌纤维的出现断裂。Masson三色染色×400
图3非肝硬变患者脾动脉内弹性膜呈波纹状排列。纤维染色 Weigert法×400
图4肝硬变患者脾动脉内弹性膜折叠的波纹变得平坦或完全消失,并分裂成多层及断裂。
弹性纤维亦有断裂。弹性纤维染色 Weigert法×400
2．透射电镜观察：正常脾动脉平滑肌细胞形态近似梭形，末端有分叉，细胞核呈长圆形。胞浆中有肌丝、线粒体、内质网、高尔基复合体等细胞器和糖原颗粒。核膜清晰致密。肝硬化患者脾动脉内皮细胞脱落。内弹性膜分裂、变平坦和断裂，弹性纤维亦有断裂。中膜平滑肌细胞数量增多，并迁移至内膜下，大小、形态不一，部分萎缩、变性，局部胞浆坏死形成空泡，甚至整个肌细胞溶解呈粘液湖样，核膜增厚和染色体聚积。线粒体数目增多并肿胀，嵴消失，形成空泡。整个管壁内胶原纤维明显增多并排列紊乱（图5）。部分肌细胞胞浆内出现较多粗面内质网、核糖体及高尔基体，而肌丝减少，提示平滑肌细胞由收缩型向合成型转变（图6）。
图5肝硬变患者脾动脉透射电镜观察。平滑肌细胞变性 萎缩、胞浆溶解，
空泡样改变。管壁胶原纤维增多 铅铀双染×6000
图6肝硬变患者脾动脉透射电镜观察,平滑肌细胞的胞浆内出现较多粗面内质网和高尔基体,
肌丝减少,表型从收缩型向合成型转化。核膜增厚。线粒体嵴消失，形成空泡 铅铀双染×8000
3．平滑肌细胞iNOS免疫组化染色：正常人呈阴性或弱阳性反应（图7）。肝硬化患者呈强阳性，位于平滑肌细胞的胞浆内（图8）。肝硬化组患者OD值91.28±24.15，正常对照组OD值24.16±4.16，二组患者OD值差异有非常显著性意义（P＜0.01）。
图7非肝硬变患者脾动脉呈阴性或弱阳性反应 iNOS免疫组化染色×400
图8肝硬变患者脾动脉呈强阳性染色,阳性颗粒位于平
滑肌细胞的胞浆内 iNOS免疫组化染色×100
讨论
本组资料观察发现门静脉高压症患者的脾动脉壁有以下病理改变：
1．平滑肌细胞的病理变化：平滑肌细胞出现多种形式的病理变化，包括表型转变（phenotypic changes）和增殖、迁移、变性、萎缩、断裂等。目前认为，血管平滑肌细胞有收缩型和合成型二种，二者可互相转化。收缩型的胞浆中含丰富的肌丝和α-肌动蛋白，合成型的胞浆中粗面内质网和高尔基体增多，收缩能力差，但移动性、增殖和分泌能力强，可合成细胞外基质［4，5］。正常人脾动脉内膜无平滑肌细胞，而门静脉高压症患者内膜下间隙聚积有大量平滑肌细胞，并有细胞外基质沉积。据Ross［6］观察发现，大动脉和中动脉的内膜和中膜没有成纤维细胞，而平滑肌细胞是动脉中膜唯一类型的细胞。故我们认为，门静脉高压症患者脾动脉内膜下的平滑肌细胞来自中膜。门静脉高压症时脾动脉内血流动力学改变能刺激中膜平滑肌细胞增殖、迁移和表型转变。从而导致内膜增厚，其结果可使脾动脉顺应性下降，运动受限制，反应性减弱，并损伤血管内皮细胞。
由于中膜收缩型的平滑肌细胞减少，管壁的收缩力因而减少，而合成型的平滑肌细胞增多，使中膜异常聚积过多的细胞外基质。因而脾动脉可发生胶原化和 纤维化，导致管壁增厚变硬，弹性下降。另外，平滑肌细胞被细胞外基质分隔，使肌细胞间距增大，以及变性、萎缩和断裂的平滑肌细胞增多，亦能削弱其收缩力。
2．管壁弹性结构破坏：内弹性膜是维持动脉壁弹性的主要结构，它能增加动脉壁的刚性，可有效地缓冲血流对血管壁的冲击。门静脉高压症合并脾肿大、脾亢，脾动脉血流量明显增加，使脾动脉被动扩张，故内弹性膜被拉直，当张力超过其能耐受的最大限度时，便在薄弱处发生断裂，从而使脾动脉的弹性结构破坏、舒缩功能因而受损。
3．平滑肌细胞iNOS活性增强：本组标本经免疫组织染色发现，正常人脾动脉iNOS为阴性或弱阳性，而肝硬化患者则呈强阳性表达，表明脾动脉内血流量增加等因素，能在转录水平促进平滑肌细胞表达iNOS，并可催化其生成过量的一氧化氮（NO）。NO作为一种内源性扩血管物质［7］,可使脾动脉扩张。NO为性质不稳定的自由基，有强有力的氧化能力［8］，故大量NO的毒副作用亦能损伤血管壁，破坏其收缩结构。
脾动脉的上述病理变化表明，门静脉高压症不仅可继发门静脉及其属支的结构与功能变化，而且可合并内脏的动脉病变，使其收缩结构破坏，导致动脉扩张，收缩力减弱和对缩血管活性物质反应性下降。我们认为，这是形成高动力循环异常的原因之一。门静脉高压症、内脏动脉病变和高动力循环异常三者间是否有相互促进、互为因果的“恶性循环”关系，还有待研究。
作者单位：430030 武汉，同济医科大学同济医院外科(杨镇、李大鹏、裘法祖)，病理解剖教研室(任大宏)
参考文献
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