张余光 张涤生 李志海 祁佐良 王炜
Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis
Zhang Yuguang,Zhang Disheng,Li Zhihai,et al
【摘要】 目的 针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源
性活性蛋白(SCF)进行调控，以增加胶原基因的表达。方法 应用真皮成纤维细胞培养、胶原
基因mRNA裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。
结果 以Actin作为对照，SCF对老人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型
胶原基因表达增加，处理后，I型胶原基因表达增加150 %，Ⅲ型胶原基因增加50 %。
结论 SCF可以促进衰老真皮成纤维细胞胶原基因的表达。
【关键词】 胶原基因表达 皮肤衰老
Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis. Zhang Yuguang,
Zhang Disheng,Li Zhihai,et al. Department of Plastic Surgery, No. 9 Peoples Hospital,
Shanghai Second Medical University. 200011 ( Zhang Yuguang,Department of plastic Surgery,
ZhuJiang Hospital of First Militarg Medical University 510282)
【Abstract】 Objective In accordance with expression decrease of collagen gene in aging
fibroblasts, SCF was used to increase collagen gene expression.Method With fibroblasts cultrue,
collagen gene hybridization and image pattern analysis, the regulative effect of SCF for collagen gene
was observed. Result In contrast with Actin, SCF can obviously make the collagen gene expression
of type Ⅰand type Ⅲ increase by 150 % and by 50 % respectively.Conclusion SCF can increase
collagen gene expression in aging fibroblasts of dermis.
【Key words】 Collagen gene Aging demis
皮肤老化与真皮间质蛋白、胶原含量及性质有关。病理学观察发现，随年龄增长和超量
紫外线照射，弹力纤维逐渐变性、增厚，胶原含量逐渐减少，真皮中成纤维细胞数量减少，
胶原纤维断裂，胶原稳定性增加。皮肤胶原含量和性质变化包括两方面：①真皮细胞中成纤
维细胞寿命缩短，合成、分泌胶原的能力降低，胶原降解延缓，新陈代谢缓慢。②日光对胶
原的损伤，胶原老化变性，结果使真皮变薄，弹力降低，皮肤松弛。第二方面的变化可通过
皮肤结构的重塑得到矫正，而第一方面的变化只有通过调控胶原基因，增加胶原蛋白的分泌，
使真皮胶原损伤得以修复，增加胶原蛋白代谢，使真皮中保留可溶性、非稳定胶原。
材料与方法
一、细胞培养
1.皮肤来源：老人皮肤来源于55～60岁手术病人，中青年人皮肤来源于30～35岁病人，
小儿皮肤来源于初生～2岁小儿。
2.培养：按王氏方法，将不同年龄组皮肤的表皮细胞和成纤维细胞消化培养。小儿细胞
进行持续传代培养，原代培养4天后收集细胞，将细胞浓度调至2×106/ml，按不同处理组加
入调控剂。
3.分组：
①老人表皮细胞组；②老人表皮细胞VBT处理组；③老人成纤维细胞组；④ 老人表皮细
胞EGF处理组；⑤小儿表皮细胞组；⑥老人成纤维细胞SCF处理组；⑦小儿成纤维细胞组；
⑧老人成纤维细胞VBT处理组；⑨老人表皮细胞SCF处理组 ；○10老人成纤维细胞EGF处理组。
调控处理组，在培养基中加入各种调控物质，浓度如下：
VBT 1 mg/ml； ECF 0.2 mg/ml； SCF 1.0 mg/ml
4.调控药品：
EGF：表皮生长因子(上海生化所)；
VBT：维生素BT(上海第二军医大学)；
SCF：胎儿成纤维细胞提取物(上海第二医科大学)。
二、RNA提取
采用异硫氰酸胍一酸一氯仿法。
三、含目的探针的质粒来源
Plasmid PHFS含Ⅲ型前胶原基因控针、Plasmid PHCALIU含Ⅰ型前胶原基因探针，均
由芬兰Turku 大学的Eero Vuorio 教授惠赠。
四、两种cDNA探针制备
1.提取质粒DNA：参考Summerton 方法［1］；
2.胶原cDNA片段的酶切及回收；
3.Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA探针的同位素标记。
用BRL公司的缺口平移试剂盒和Amersham公司的α-32P-dATP进行标记，测定标记探
针放射比活为5×107 cpm/μg。
五、杂交方法(RNA点印迹杂交)：浸湿NC和Whatman 3MM滤纸各1张。
将Whatman 3MM滤纸放在仪器上，加盖拧紧，接到真空泵上，在50 μ 120×SSC中加入1～2μg
待测RNA，加入仪器孔中，关闭真空泵，取下仪器盖及滤膜，NC滤膜夹在2张新的Whatman 3MM滤纸
之间放在真空炉中80 ℃烤2小时，用6×SSC、2×Denbardt 试剂0.1 %SDS 进行预杂交。在预杂交液
中加入变性的放射性标记探针0.2 μg/100 μl，在适宜的温度下继续温育16～24小时，
用1×SSC 0.1 % SDS于室温洗膜20分钟，随后用0.2×SSC 0.1 % SDS于68 ℃洗膜3次，每次20分钟，
用X光片进行放射自显影，于－70 ℃曝光24～48小时［1，2］。
六、杂效斑点图像分析：以Actin作为内对照(Actin 斑点灰度为100%)。
结 果
一、EGF 对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控。
表1 EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF Ⅰ Ⅲ
斑点 灰度 斑点 灰度
处理前 40% 45%
处理后 45% 40%
Actin对照
100% 100%
图像分析结果显示EGF对Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的表达无明显调控作用(P＞0.05)。
二、VBT对老年成纤维细胞胶基因表达的调控。
表2 VBT对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF Ⅰ Ⅲ
斑点 灰度 斑点 灰度
处理前 40% 45%
处理后 98% 86%
Actin对照
100% 100%
图像分析结果显示，VBT可使两种胶原基因表达增加，但对Ⅰ型胶原基因的表达调控作用
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