王忠彪 孙逊 李勇 俞璎 戴金凤 陈常庆 范维琥
【摘要】 目的 建立稳定表达人血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)的细胞株,并考察该重组蛋白与损伤修复有关的生物学作用。方法 将含PDGF-B基因的真核表达载体pcDNA3转染小鼠成纤维细胞NIH3T3中,在G418选择压力下得到抗性克隆,收集扩增的抗性克隆培养液并制备细胞膜上PDGF-BB蛋白质,3H-TdR掺入法表达产物的生物学活性,并以3H-Pro掺入测胶原合成率。结果 免疫荧光染色法证实抗性细胞中PDGF-BB的表达,膜上PDGF-BB显著促进NIH3T3细胞DNA合成,活性可达约31.2U/106细胞,而培养液的致丝裂活性低于可检测水平。抗性细胞的胶原合成率显著增高。结论 PDGF-BB的真核表达系统已得以成功构建,该重组蛋白可促进成纤维细胞增生和胶原合成,提示其在损伤修复中有潜在应用价值。
【关键词】 血小板衍生生长因子 基因 表达 NIH3T3细胞
PDGF-B Gene Expression and Its Stimulating Effect on Fibroblast Proliferation and Collagen Synthesis WANG Zhong-biao*, SUN Xun, LI Yong, et al. *Dept. of Cardiology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Aim To study the biological effect of human platelet-derived growth factor (PDGF)-BB on injury healing. Methods A recombinant eukaryotic vector containing human PDGF-B gene was transduced into mouse fibroblasts NIH3T3. The positive clones were obtained under the selection of G418-media. The media and the membrane fractions of the drug resistance cells were well respectively prepared for assaying their biological activity by means of 3 H-TdR incorpration. The effect of PDGF-BB on the collagen synthesis of the fibroblasts was estimated with 3 H-Proline incorpration. Results The recommbinant protein of the drug resistance cell membrane significantly stimulated the DNA synthesis of NTH3T3 cells with the mitogenic activity about 31.2U/106 cells while the activity in the media was below the detectable level. The PDGF-BB antigen in drug resistance cells was positive in immunofluorescent staining while that in the control group was negative, and the drug resistance cells had significantly higher 3 H-proline incorpration than that of the control cells. conclusion A cell strain expressing biologically active PDGF-BB was successfully established. The recombinant PDGF-BB stimulated the mitogenesis and collagen synthesis of the fibroblasts, which may have some clinical value in injury repair.
【Key words】 Platelet-derived growth factor Gene Expression NIH3T3 cell
血小板衍生生长因子(PDGF)是由二硫键相连,反向平行的两条链(A或B链)构成,有三种二聚体形式(PDGF-AA,-BB,-AB)具有多种生物学功能。诸如它是多种细胞的强力丝裂原和趋化物。目前研究发现外科手术后和/或损伤修复过程中伴随有局部PDGF-B链基因表达量的升高和受体的上调等,此外尚有许多研究结果提示它在损伤修复中起重要作用,甚至被称为损伤修复因子,美国FDA也已批准其进入软组织损伤和糖尿病溃疡方面的临床试验。
制备具有生物学活性的PDGF,不仅具有潜在的临床应用价值,而且有助于评估其在某些相关疾病(如动脉粥样硬化,恶性肿瘤等)中的确切作用。本研究旨在建立PDGF-B链基因的真核表达系统并深入考察其与损伤修复密切相关的生物学作用。
材料与方法
一、基因、细胞、菌株与试剂
本实验所用的PDGF-B cDNA由美国哈佛医学院Collins等构建并提供,长约2.2kb以EcoRI插入质粒pUC9,真核表达载体pcDNA3由中国科学院基因库提供,3H-TdR和3H-Proline购自中国原子能研究院同位素研究所,Ecoli.JM103、DH5α菌株用于扩增质粒,限制性内切酶、T4DNA连接酶,脂质体转染试剂Lipofectamine等购自Promega公司,NIN3T3细胞购自中国科学院细胞生物研究所,细胞培养基、G418为GIBCO-BRL公司产品,PDGF-BB标准品、兔抗PDGF-BB抗体,羊抗兔荧光抗体分别由Promega、华顺,华美公司提供。
二、质粒转化、扩增、抽提、酶切和片断回收
按标准方法［1］进行。
三、重组质粒pcDNA3 PDGF-B的构建
限制性内切酶BamH 1和EcoR 1分别酶切pcDNA3和PUC9 PDGF-B,回收载体和供体目的片断,在T4DNA连接酶作用下进行连接反应,经转化、抽提和酶切鉴定后,将重组质粒命名为pcDNA3 PDGF-B。
四、NIH3T3细胞的转染和筛选、转移、扩增
转染前1天,将NIH3T3细胞按2×105个/孔接种于6孔板,过夜培养后吸弃原完全培养基,以无血清培养基轻洗2次,用脂质体介导转染法［2］将重组质粒pcDNA3PDGF-B转染细胞,然后恢复生长至近融合,再1∶3传入另外6孔板,用含有G418(500μg/ml)的完全培养基筛选培养形成单克隆,再经96孔板、6孔板筛选培养,转入培养瓶培养。细胞长至近融合时,弃原培养液,Hanks液洗3次,改用无血清培养基4ml再培养6小时,收集条件培养基,待测。
五、膜蛋白的制备
用低渗裂解法［3］裂解细胞,离心(1 000×g,10min)除去细胞核,上清液再经离心(100000×g, 90min)沉淀膜组份,以10mMPB(pH7.4)复悬膜沉淀物,煮5分钟,再离心(100 000×g,45min)重新沉淀膜,收集上清备测。
六、免疫荧光细胞化学染色
转染后的NIH3T3细胞传入自制的载玻片上培养,2天后取出载玻片,PBS洗3次后丙酮/甲醇固定5分钟,再以PBS洗,在玻片上滴加1∶100稀释的一抗,湿盒中孵育1小时PBS洗后滴加1∶45稀释的荧光抗体,孵育30分钟后,荧光显微镜下观察并拍照。
七、表达产物的致丝裂活性检测
参照文献［4］,将NIH3T3细胞以含10%小牛血清的DMEM调成细胞悬液,按2×104个/孔传入96孔板,37℃孵箱中培养6天,使细胞达静止。待测样品直接加入,继续孵育16小时,加入0.2μci 3 H-TdR,孵育5小时,然后用10%三氯乙酸固定,0.25N NaOH溶解,进行液闪计数。参照Promega公司提供的标准方案,以引起半最大刺激反应的生长因子浓度为一个活性单位,以PDGF-BB标准品为参照。
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