高颖 张孝斌 陈必良 马向东 郭慧玲
摘要 目的：研究抑癌基因P53及其表达产物P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达，比较P53 mRNA表达与P53蛋白表达的关系。方法：应用免疫组织化学及核酸分子原位杂交方法检测P53基因及其产物的表达情况。结果：原位杂交显示，P53 mRNA在肾上腺嗜铬细胞瘤中表达为24.0%(7/29)，在恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中为14.0%(1/7)；免疫组织化学显示，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞癌中表达为79.3%(23/29)，在恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中为71.0%(5/7)。结论：在肾上腺嗜铬细胞瘤中，存在P53基因突变，推测P53基因与肾上腺嗜铬细胞瘤发生、发展有显著相关性。
关键词 嗜铬细胞瘤 P53基因 肾上腺肿瘤 基因表达 P53蛋白质
Expression of antioncogene P53 mRNA and its protein in human
adrenal pheochromocytomas
Gao Ying? Zhang Xiaobing? Chen Biliang et al
(?Department of Urology,First Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,430060)
Abstract Purpose:To investigate the expression and machanism of antioncogene P53 mRNA and its protein in human adrenal pheochromocytoma.Methods:In situ hybridization (ISH) was employed to detect P53 mRNA in pheochromocytoma.P53 protein was examied by SP immunohistochemistry.Results:ISH showed 24.0% (7/29) had the expression of P53 mRNA in pheochromocytomas (7/29) and 14.0% (1/7) in malignant pheochomocytomas (1/7).23 had the expression of P53 protein in 29 cases of pheochromocytomas (79.3%) and 5 in 7 cases of malignant pheochromocytomas (71.0%).Conclusions:The mutation of P53 gene might be very important in and responsible for pathogenesis of pheochromocytomas.
Key words Pheochromocytoma P53 gene Adrenal gland neoplasms Gene expression P53 protein
肾上腺嗜铬细胞瘤发生、发展的机制目前并不清楚，在分子水平上的发病机制还没有完全建立。本研究拟通过对肾上腺嗜铬细胞瘤中抑癌基因P53 mRNA及其表达产物P53蛋白的检测，探讨抑癌基因P53及其基因表达产物在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达规律、意义以及与肾上腺嗜铬细胞瘤发生、发展的关系。
1 材料和方法
1.1 标本
选用1988～1999年湖北医科大学第一附属医院及第四军医大学西京医院经病理证实为肾上腺嗜铬细胞瘤共36例存档石蜡包埋标本，其中恶性嗜铬细胞瘤7例。标本做5 μm厚连续切片。
1.2 试剂
P53原位杂交探针及P53蛋白抗体均购于武汉博士德公司，用德国Boehringer Mannheim公司地高辛检测试剂盒进行探针标记和检测；SP(链霉抗生物素蛋白-过氧化物酸)免疫组织化学(免疫组化)试剂盒、DAB显色试剂盒为美国Zymed公司产品。
1.3 SP免疫组化方法
切片常规脱蜡至水，柠檬酸溶液微波炉抗原修复，免疫组化过程均按说明书严格操作。
1.4 P53 mRNA原位杂交
①切片烤片；②组织切片梯度酒精脱蜡至水；③40 mg/L多聚甲醛固定，0.2 ml/L DEPC室温10 min，5 mg/L蛋白酶K 37℃消化10 min，甘氨酸液浸10 min终止反应；④杂交：滴加预杂交液42℃孵育30 min，杂交探针100℃变性10 min，-20℃ 3 min，滴加于组织切片上，2×SSC温盒内42℃杂交过夜；⑤洗涤、显色：2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、Buffer Ⅰ充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，Dig-Ap(1∶500)37℃孵育2 h，BufferⅡ洗涤、Buffer Ⅲ平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，BufferⅤ终止反应，脱水、透明、封片。
1.5 结果判定
免疫组化以细胞核或细胞浆中出现棕黄色为阳性。原位杂交结果以胞浆内出现紫蓝色颗粒为阳性，设RNase消化为阴性对照，不含探针的预杂交液代替杂交液为空白对照。结果经χ2检验。
2 结果
2.1 免疫组化
用P53单抗对肾上腺嗜铬细胞瘤细胞中的P53蛋白进行免疫组化检测，结果见表1。
表1 P53免疫组化表达情况
标本 例
数 P53蛋白 阳性率
(%) P值
＋ -
肾上腺嗜铬
细胞瘤 29 23 6 79.3
恶性肾上腺
嗜铬细胞瘤 7 5 2 70.0 ＞0.05
2.2 原位杂交
应用P53 cDNA探针，对肾上腺嗜铬细胞瘤组织中P53 mRNA进行原位杂交检测，结果见表2。
表2 P53原位杂交表达情况
标本 例
数 P53 mRNA 阳性率
(%) P值
＋ -
肾上腺嗜铬
细胞瘤 29 7 22 24.1
恶性肾上腺
嗜铬细胞瘤 7 1 6 14.2 ＞0.05
3 讨论
P53基因是一种细胞生长的负调节因子，通过调节细胞生长，监护细胞DNA完整性，诱导DNA受损又未能修复的细胞发生凋亡，阻止基因突变，阻止有癌变倾向的细胞产生，从而发挥抑癌作用〔1〕。若野生型P53基因发生突变失活，P53的抑癌作用便丧失。突变型P53基因表达的P53蛋白有与野生型P53蛋白相反的作用，即具有促进细胞增殖和肿瘤形成的作用〔2〕 。在免疫组化技术中，野生型P53蛋白由于不稳定、易水解、半衰期短等原因而不能检测出，而P53单抗在免疫组化中出现阳性表达时是突变型P53基因表达的结果，说明P53基因已经突变〔3〕。在本组实验中，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达阳性率为79.3%，在恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中表达率为71.0%。说明P53基因突变在肾上腺嗜铬细胞瘤发生、发展中有非常重要的意义。
用P53核酸探针对本组肾上腺嗜铬细胞瘤进行P53 mRNA原位杂交检测，发现在肿瘤细胞中，P53 mRNA表达的阳性率较低。结合突变型P53蛋白在本组标本中的高表达，可以推测在肾上腺嗜铬细胞瘤的分子发病机制中，P53基因的突变和异常表达起非常重要的作用。
P53蛋白和P53 mRNA在肾上腺良性和恶性嗜铬细胞瘤中表达率无显著性差异，故用P53基因进行肾上腺嗜铬细胞瘤的良、恶性鉴别是不合适的。
作者单位：高颖 张孝斌 湖北医科大学第一附属医院泌尿外科(武汉，430061)
陈必良 马向东 郭慧玲 第四军医大学西京医院
参考文献
1 Lane DP.Guardian of the genome.Nature,1992,358:15～16
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