祁晓平 刘福坤 黎介寿
【摘要】 目的 探讨术前选择性动脉灌注化疗对直肠癌细胞凋亡和增殖的影响。 方法 对114例直肠癌患者化疗前后的肿瘤组织及12例正常直肠粘膜，分别采用TUNEL法和S-P法测定细胞凋亡指数(AI)和增殖指数(PI)。 结果 本组患者化疗前及化疗后7～12 d，AI分别为5.81‰、10.99‰；PI分别为49.27‰、57.38‰，差异均有显著性意义（P<0.01）；高PI组患者化疗后AI的增加值显著高于低PI组,差异均有显著性意义（P<0.01）。 结论 术前选择性动脉灌注化疗能诱导直肠癌细胞凋亡，对高PI的癌细胞作用更加显著，并且能暂时抑制癌细胞增殖;化疗后7～12 d，癌细胞增殖速度高于化疗前，提示化疗后应及时进行手术。
关键词 结肠直肠肿瘤； 药物疗法，联合； 灌注，局部； 增殖细胞核抗原； 凋亡
Effects of selective preoprative intra-arterial infusion chemotherapy on apoptosis and proliferation of rectal cancer cells
QI Xiaoping LIU Fukun LI Jieshou
（Institute of General Surgery, Nanjing General Hospital, People′s Liberation Army, Nanjing 210002，China.）
【Abstract】 Objectives To study the effects of anti-cancer drugs on apoptosis and proliferation of rectal cancer cells in vivo. Methods 114 patients with rectal cancer were treated by selective preoprative intra-arterial infusion chemotherapy. The rectal tumor tissues were derived before chemotherapy and 7－12 days after this treatment. In the tissues， apoptotic cells were examined by TUNEL method, and the expression of PCNA was examined by S-P staining. Results Before chemotherapy, the mean AI of tumor cells was 5.81‰ before chemotherapy and 10.99‰ 7－12 days after chemotherapy (P<0.01). The mean PI of tumor cells before chemotherapy and 7－12 days after chemotherapy was 49.27% and 57.38% (P<0.01). The mean AI of the high PI group increased more evidently than that of the low PI group. Conclusions This treatment induced apoptosis of rectal cancer cells and inhibit tumor cell proliteration. The mean AI of the high PI group was higher than that of the low PI group. It is suggested that this operation should be performed shortly after chemotherapy.
【Key words】 Colorectal neoplasms； Drug therapy, combination； Infusion,regional； Proliferating cell nuclear antigen； Apoptosis
大量证据表明，化疗药物主要是通过启动凋亡机制杀伤肿瘤细胞的。但细胞增殖和细胞凋亡一样是最基本的细胞学过程。针对同样的靶细胞，化疗后细胞增殖和细胞凋亡将发生变化，我们观察了选择性动脉灌注化疗前后114例Dukes C期直肠癌患者癌细胞增殖和凋亡的改变，现报告如下。
资料与方法
1．一般资料：本组病例为1993年10月至1996年12月在本院治疗的114例直肠癌患者，男性71例，女性43例；平均年龄（49±16）岁；病例分期均为Dukes C期。其中绒毛管状腺癌49例，管状腺癌或管状腺癌伴粘液腺癌50例，其余15例为粘液腺癌、
乳头状管状腺癌等。所有患者均分别在化疗前及化疗后7～12 d接受直肠癌根治术时留取直肠癌标本，另取12例正常直肠粘膜作为对照组。
2．化疗方案：所有患者均于手术前作单次选择性动脉插管化疗，采用Seldinger法，经右侧股动脉穿刺插管至靶血管，注射造影剂，在肿瘤显影后，灌注化疗药物：顺铂60 mg/m2，CF 200 mg/m2，5-氟脲嘧啶（5-Fu）600～750 mg/m2。
3．凋亡指数(AI)及增殖指数(PI)的检测：AI的检测：标本取下后立即用10%中性甲醛固定4～10 h，梯度酒精系列脱水，石蜡包埋后切片。采用TdT介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL)染色检测凋亡细胞(试剂由德国Borringerman公司提供)，以细胞核呈棕黄色染色者为凋亡细胞。在400倍高倍视野下，随机选取5个癌区，计算凋亡细胞在全部癌细胞中所占的比例。每次染色均设空白对照(以不含TdT的液体代替反应液)和阳性对照(DNA内切酶预处理过的组织切片)。
AI=凋亡细胞数/癌细胞总数×100‰
PI的检测：采用链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶(S-P)免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)，S-P免疫组化染色试剂盒由迈新生物技术公司提供，PCNA染色结果的计数方法与凋亡细胞的计数方法相同。
PI=PCNA阳性细胞数/癌细胞总数×100‰
4．统计学处理：数据以±s表示，采用配对t检验进行统计分析。
结果
1．化疗前直肠癌细胞AI低于对照组细胞，差异有极显著性意义(P<0.01)；介入化疗后7～12 d直肠癌细胞AI升高，与化疗前相比差异有显著性意义(P<0.01，表1)。介入化疗前高PI者65例，低PI者49例，化疗后高PI者AI的增加值为（7.68±2.13）‰，低PI组AI的增加值为（5.04±1.16）‰，两者相比差异有极显著性意义(P<0.01)。
2．化疗前直肠癌患者癌组织PCNA表达高于正常肠粘膜；介入化疗后7～12 d，PCNA的表达呈反跳趋势，高于化疗前，差异有极显著的意义(P<0.01，表1)。
表1 介入化疗前后癌组织AI和PI的变化及与
正常对照的比较(±s，‰)
项 目 化疗组(114例) 正常对照
（12例）
化疗前 化疗后
AI 5.81±1.67
10.99±2.14*
21.34±32.07
PI 49.27±14.05 57.38±13.10* 45.56±13.10
注：与化疗前及对照组相比*均P<0.01
讨论
我国是直肠癌的高发区之一，尽管手术后放、化疗法取得了一定的疗效，但仍有半数以上的患者5年内将发生局部复发和远处转移。鉴于手术前选择性动脉灌注化疗能杀灭原发灶中的癌细胞，缩小原发灶，减少或消灭微小转移，提高手术根治性切除率，改善预后［1］，术前选择性动脉插管化疗越来越受到重视。我们曾观察了12例直肠癌患者介入化疗后第1～10 d各个时相癌细胞凋亡和增殖的动态变化，发现动脉灌注化疗后24 h，癌细胞的AI迅速增加到最高峰，然后逐渐下降，但至7～10 d时，仍然显著高于介入化疗前；同时还发现直肠癌患者化疗前癌细胞PCNA的表达明显增高，介入化疗后暂时下降，48 h降至最低点，以后逐渐回升，至7～10 d时已明显高于化疗前，表现出更为活跃的增殖活性［2］，本组资料进一步证实了以上的研究结果。
已有研究证明将5-Fu加入培养的细胞中，24 h内即观察到细胞凋亡的发生［3］。顺铂是细胞周期非特异性药物，铂类制剂中的铂原子能嵌合于DNA内部，使DNA断裂，从而阻断其复制和转录。顺铂用于小鼠，其癌细胞凋亡高峰在10～18 h出现［4］。CF能增加5-Fu的生物活性，增强与胸腺酸盐合成酶竞争抑制。因此采用此联合化疗方案选择性动脉灌注，不仅仅依赖特异的生物靶分子作用杀伤肿瘤细胞，更依赖于诱导肿瘤细胞凋亡［5］。大肠癌是一种生物学上生长缓慢的癌，动脉灌注化疗可使癌灶局部药物浓度增高，使化疗药物，尤其是5-Fu暴露时间延长，增强对癌细胞，尤其是G0期癌细胞的诱导凋亡作用。
本研究还发现，介入化疗后7～12 d，虽然增殖活跃的癌细胞AI较化疗前显著增高，但也表现出更加活跃的增殖活性。这一反跳现象除了提示手术应该在此时间前及时进行外，还提示介入化疗只是使肿瘤组织的增殖活性暂时受到抑制。临床治疗中，如何诱导直肠癌组织中大部分处于G0期的癌细胞的分化，降低其增殖速度，加速其凋亡，把处于不同增殖周期的靶细胞，用不同的药物和治疗方法，以凋亡的概念统一起来，仍是值得研究和探讨的课题。
作者单位：祁晓平（南京军区南京总医院全军普通外科研究所 210002）
刘福坤 （南京军区南京总医院全军普通外科研究所 210002）
黎介寿（南京军区南京总医院全军普通外科研究所 210002）
参考文献
1，Vouthey JN, Marsh W, Cendan JC，et al. Arterial therapy of hepatic colorectal metastasis. Br J Surg, 1996,83:447-455.
2，刘福坤，祁晓平，陈晓亮，等．术前介入化疗对直肠癌细胞凋亡和增殖的影响．中华外科杂志，1999，37：225-227.
3，Huschtscha LI, Bartier WA. Andersson CE, et al. Charateristis of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vitro. Br J Cancer, 1996,73:54-60.
4，al-sheneber IF, Shibata HR, Sampalis J, et al. Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer. Cancer, 1993,71:1954-1959.
5，Hale AJ, Sminth CA, Sutherland LC, et al. Apoptosis:molecular regulation of cell death. Eur J Biochem, 1996,236:1-4.
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