荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究

黄宇闻　程庆文　莫琴　谢如锋　钱开诚 　　提要　以细胞感染试验、凝血法、交叉免疫电泳等技术，观察荧光与亚甲蓝联用对血浆中水泡性口炎病毒（VSV）和辛德比斯病毒（SV）的灭活效果及血浆蛋白的变化。结果，向盛装在聚氯乙烯袋内的血浆中加1 &mu;mol/L亚甲蓝并经荧光(30 000 Lux)照射30 min，可将血浆中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV灭活。消毒后，血浆中的Ⅷ:C、Ⅸ:C、纤维蛋白原的回收率>75％，白蛋白、球蛋白的回收率>85％，蛋白免疫原性无变化。 　　关键词　协同灭活病毒作用　　荧光　　亚甲蓝　　血浆消毒　　水泡性口炎病毒　　辛德比斯病毒 STUDY ON INACTIVATION OF VIRUS IN PLASMA BY COMBINATION OF FLUORESCENCE AND METHYLENE BLUE Huang Yuwen　Cheng Qingwen　Mo Qin　Xie Rufeng　Qian Kaicheng (Shanghai Blood Center, Shanghai 200051) Abstract　Techniques such as cell infection test, blood coagulation method and crossed immunoelectrophoresis were used to observed the efficacy of combination of fluorescence and methylene blue in inactivating vesicular stomatitis virus (VSV) and Sindbis Virus in plasma and the changes in plasma protein. The results showed that addition of 1 &mu;mol/L methylene blue to the plasma in polyvinyl chloride bag which was also exposed to fluorescence (30000 Lux) irradiation for 30 min could inactivate VSV and SV with titers >7 TCID50 (lg) in plasma. After disinfection, the recovery rates of FⅧ:C， FⅨ:C and fibrinogen were >75% and the recovery rates of albumin, globulin (IgG, IgA, IgM) were >85%, while no change in protein immunogenicity was observed. 　　Key words　synergetic inactivating effect on virus　　fluorescence　　methylene blue　　plasma disinfection　　vesicular stomatitis virus　　Sindbis virus 　　为防输注血浆引起感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等的危险，已研究出多种对血浆中病毒灭活的方法，如加热法、有机溶剂加表面活性剂（S/D）法、乙型丙内酯加长波紫外线法等〔1〕。对临床用单袋血浆中病毒的灭活，上述方法均不适宜，而宜采用亚甲蓝加可见光照射　法〔2〕。我们将染以指标病毒的血浆盛装于聚氯乙烯（PVC）袋内，向血浆中加亚甲蓝后经不同光源照射，观察病毒灭活效果及其对血浆蛋白质的影响。发现以荧光光源照射者对病毒灭活效果较好，血浆内各种蛋白损失较小。为此，对亚甲蓝加荧光照射法进行了较详细地研究。现将结果报道于下。 　　 　　1 方法 　　1.1 试验病毒 　　试验用水泡性口炎病毒（VSV，Indiana株）和辛德比斯病毒（SV，与VSV均由中国药品卫生制品鉴定所提供），分别以非洲绿猴肾细胞（Vero）、BHK细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度>7 lgTCID50/ml，分装于无菌塑料试管中，置- 80℃保存，备用。 　　1.2 含病毒血浆的制备及灭活试验 　　随机取采血后6 h内分离冰冻的ACD (acid-citrate-dextrose)抗凝血浆（盛装于PVC塑料袋内，100 ml/袋），于37℃融化后，按血浆∶病毒液＝9∶1的容量比接种病毒，混匀。 　　试验时，取该血浆1 ml作为消毒前对照，取该血浆99 ml加入100 &mu;mol/L的注射用亚甲蓝1 ml（血浆中亚甲蓝浓度为1 &mu;mol/L），随即用荧光（30 000 Lux）照射30 min。 　　1.3 病毒的滴定 　　病毒滴定均按终点稀释法，在96孔板上进行。样本经10倍梯度稀释，每一稀释度接种4～6孔。同时设有细胞对照，并盲传三代。据细胞病变效应（CPE），按Karber公式计算TCID50。 　　lg TCID50=l-d(s-0.5) 　　式中，l为病毒最高稀释度的对数，d为稀释度对数间差数，s为病变细胞比例总和。 　　1.4 血浆蛋白的测定 　　　FⅧ:C及FⅨ:C活性的测定按一期　法〔3〕进行，纤维蛋白原含量测定采用凝血法。蛋白质含量（包括白蛋白和球蛋白）用比浊法测定。以交叉免疫电泳法测定消毒前后血浆蛋白质免疫原性变化。 　　1.5 动物安全试验 　　取约3 kg体重健康家兔6只。试验前，置于固定器中停止给食2 h。然后，从耳静脉抽血（抽血量为6.5 ml/kg体重）。分离血浆，加入亚甲蓝至试验浓度并经荧光照射30 min后，-20℃冻存。一周后，将该血浆对家兔作自身回输，观察体重与体症状况。 　　 　　2 结果 　　2.1 灭活病毒效果 　　在血浆中加1 &mu;mol/L亚甲蓝经荧光（30 000 Lux）照射30 min，可使血浆中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV达到灭活（表1）。单对血浆中VSV，只要加0.10 &mu;mol/L亚甲蓝经荧光照射30 min，即可灭活（表2）。细胞对照盲传3代均未见崐特异CPE。 　　　表1 亚甲蓝加荧光照射对血浆中病毒的灭活效果 　　　Table 1 Efficacy of methylene blue plus fluo- rescence irradiation in inactivating virus in plasma 处理时间 VSV滴度 SV滴度 Exposure VSV SV time titer titer (min) (lg,TCID50) (lg,TCID50) 15 <0.50* 1.09 30 <0.50 <0.50 >>> 　注:* 表示所用方法已测不到病毒滴度。对照病毒滴度VSV为7.5 TCID50(lg)，SV为7.28 TCID50(lg)。血浆中亚甲蓝浓度为1 &mu;mol/L。　Note: * means that the virus titer was not detected by the method used. The titer of control virus was 7.5 TCID50 (lg) for VSV and 7.28 TCID50 (lg) for SV. The concentration of methylene blue in plasma was 1 &mu;mol/L. 表2 不同浓度亚甲蓝加荧光照射对血浆中VSV的 　　　　灭活效果 　　　Table 2 Efficacy of methylene blue at different con- centrations plus fluorescence irradiation in inactivating VSV in plasma 亚甲蓝浓度 Concentra- tion of methylene blue (&mu;mol／L) 照射不同时间(min)的 VSV滴度 (lg, TCID50) VSV titer (lg, TCID50) after     更多相关文档请点击>>病毒(1312)研究(6533)蛋白(1915)血浆(401)TCID(2)VSV(4)&mu(283)in(672)